1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立采用二乙醇胺（DEA）缓冲体系进行碱性磷酸酶酶活测定的标准化操作流程，适用于对采用二乙醇胺测定系统标定活性的碱性磷酸酶产品进行酶法测定。

        本方法不适用于仅以甘氨酸单位引用比活性的碱性磷酸酶样品。

1.2 原理简介

（1）碱性磷酸酶在碱性条件下催化磷酸对硝基苯酯（p-nitrophenyl phosphate，PNPP）水解，生成对硝基苯酚和无机磷酸盐。

（2）在 37 ℃、pH 9.8 条件下，对硝基苯酚生成速率可通过 A405 nm 吸光度随时间增加的速率进行连续监测。

（3）以空白校正后的 ΔA405/min 为基础，结合反应总体积、加酶体积及 405 nm 处对硝基苯酚的毫摩尔分子消光系数，可计算样品的酶活。

        反应式如下：

        磷酸对硝基苯酯 + H2O ──碱性磷酸酶──> 对硝基苯酚 + Pi

（1）纯化水：来自去离子系统的水，电阻率约 18 MΩ·cm（25 ℃）。

（2）DEA 单位：在 37 ℃、pH 9.8 条件下，每分钟水解 1.0 μmol 磷酸对硝基苯酯所需的酶量定义为 1 个 DEA 单位。

（3）Pi：无机磷酸盐。

2 材料与试剂

2.1 主要试剂

（1）二乙醇胺。

（2）盐酸。

（3）1 M 氯化镁溶液。

（4）磷酸对硝基苯酯（PNPP）。

（5）纯化水。

（6）待测碱性磷酸酶样品。

2.2 仪器与器材

（1）恒温分光光度计。

（2）1 cm 光程比色杯。

（3）37 ℃ 恒温装置。

（4）移液器及配套吸头。

（5）pH 计。

（6）计时器。

2.3 反应条件

（1）温度：37 ℃。

（2）pH：9.8。

（3）检测波长：405 nm。

（4）光程：1 cm。

（5）检测方式：连续光谱速率法。

3 试剂准备

3.1 1.0 M 二乙醇胺缓冲液，含 0.50 mM 氯化镁，pH 9.8，37 ℃

（1）以二乙醇胺配制 140 mg/mL 的初始溶液。

（2）于 37 ℃ 条件下，用 5 M 盐酸将该溶液 pH 调至 9.8。

（3）用纯化水将已调 pH 的溶液稀释至二乙醇胺终浓度 105 mg/mL。

（4）加入 0.5 mL/L 的 1 M 氯化镁溶液。

（5）该缓冲液应新鲜配制，避光保存。

3.2 0.67 M 磷酸对硝基苯酯溶液（PNPP）

（1）以磷酸对硝基苯酯配制 247 mg/mL 溶液。

（2）该底物液应新鲜配制，避光保存。

3.3 碱性磷酸酶溶液

（1）临用前，用预冷缓冲液配制含约 0.15 U/mL 碱性磷酸酶的工作液。

（2）对于液体样品，应先在预冷缓冲液中配制浓缩储备液，建议浓度为 2000 U/mL 或更高。

（3）随后继续用预冷缓冲液逐级稀释，使最终工作液浓度约为 0.15 U/mL。

4 实验流程

4.1 预平衡

（1）将分光光度计和比色杯系统预热至 37 ℃。

（2）将缓冲液和 PNPP 底物液平衡至 37 ℃。

（3）待加酶液保持低温，使用前再加入反应体系。

4.2 反应体系配制

        按下表向各比色杯中依次加入缓冲液和 PNPP 溶液：

（1）加样后倒置混匀。

（2）将各比色杯平衡至 37 ℃。

（3）在 A405 nm 处监测吸光度，直至基线稳定。

4.3 启动反应

        在基线稳定后，向各反应杯中加入酶液如下：

（1）加酶后立即倒置混匀。

（2）迅速开始记录 A405 nm 的升高速率。

4.4 速率测定

（1）连续记录约 5 min 内的吸光度变化。

（2）每 1 min 时间区间内至少采集 4 个数据点。

（3）对每个试样及空白样，取线性最好区间的最大线性速率作为 ΔA405/min。

（4）后续计算采用样品速率减去空白速率后的净反应速率。

5 结果计算

5.1 酶活计算

        单位/mL 酶按下式计算：

        单位/mL 酶 = [（ΔA405/min 试样 − ΔA405/min 空白）× VF] / [18.5 × VE]

        其中：

（1）VF：分析体积，即反应总体积（mL）。

（2）VE：加入酶液体积（mL）。

（3）18.5：405 nm 处对硝基苯酚的毫摩尔分子消光系数。

        如样品在测定前经过额外稀释，应再乘以稀释因子 df。

5.2 单位/mg 固体

        单位/mg 固体 = 单位/mL 酶 ÷ mg 固体/mL 酶

5.3 单位/mg 蛋白

        如已知样品蛋白浓度，可进一步计算：

        单位/mg 蛋白 = 单位/mL 酶 ÷ mg 蛋白/mL 酶

6 最终分析浓度

        在 3.00 mL 反应混合物中，终浓度如下：

（1）二乙醇胺：983 mM。

（2）氯化镁：0.49 mM。

（3）磷酸对硝基苯酯：11.2 mM。

（4）碱性磷酸酶：约 0.0075 U。

7 结果判读要点

7.1 线性区间判读

（1）吸光度应在测定时间内呈良好线性增加。

（2）若曲线前段波动明显或后段趋于平台，应只选取最稳定的线性区间计算速率。

7.2 空白校正

（1）空白样用于校正底物自发水解及体系背景吸光度变化。

（2）空白速率明显升高时，应优先检查 PNPP 新鲜度、缓冲液质量及温度稳定性。

7.3 平行样一致性

（1）不同加酶体积试样所得单位/mL 结果应具有较好一致性。

（2）若三组试样差异较大，应优先检查加样误差、酶液均匀性和线性区间选择。

8 常见问题与原因分析

8.1 吸光度变化过慢

（1）酶液浓度过低。

（2）样品活性下降或失活。

（3）底物或缓冲液配制不当。

8.2 吸光度变化过快，线性区间过短

（1）酶液浓度过高。

（2）样品稀释不足。

（3）应增加预稀释倍数后重新测定。

8.3 空白值偏高

（1）PNPP 底物液不新鲜或受光降解。

（2）缓冲液 pH 偏差较大。

（3）温控不稳定导致体系背景漂移。

8.4 平行样重复性差

（1）加样顺序不一致或混匀不充分。

（2）加酶后记录不及时。

（3）酶工作液未保持低温，导致活性波动。

9 质量控制与注意事项

9.1 缓冲液控制

（1）二乙醇胺缓冲液应在 37 ℃ 条件下调节 pH 至 9.8。

（2）缓冲液需新鲜配制，避光保存。

9.2 底物控制

（1）PNPP 底物液应新鲜配制。

（2）应避免长时间暴露于光照条件下。

9.3 酶液控制

（1）酶工作液应临用前配制。

（2）整个加样前过程应尽量保持低温。

9.4 测定范围控制

（1）样品工作液应调整至约 0.15 U/mL。

（2）最终体系中酶量应控制在适合连续速率法测定的范围内，以保证 5 min 内存在可分析的线性区间。

10 安全与操作规范

10.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理二乙醇胺、盐酸及其他化学试剂时，应在通风条件良好的环境下操作。

10.2 安全资料

（1）有关危险信息和操作注意事项，应参阅相关安全数据说明书（SDS）。

10.3 废液处理

（1）含二乙醇胺、盐酸、PNPP 及酶反应残液的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品处理规范处置。

11 相关试剂与酶制品选型

表1 关键缓冲体系、底物与基础试剂选型

表2 碱性磷酸酶酶制品选型

更多相关文章，详见下方：

[1] 用碱性磷酸酶启动子和信号序列分泌表达外源蛋白实验

[2] λ 噬菌体载体 DNA 的碱性磷酸酶处理实验

[3] 用碱性磷酸酶进行 DNA 片段的去磷酸化

[4] 酸性磷酸酶显示实验

[5] 酸性磷酸酶活性测定