1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立幽门螺杆菌 May-Grünwald-Giemsa（MGG）染色的常规操作流程，适用于胃黏膜石蜡组织切片中幽门螺杆菌的形态学显示，可用于胃黏膜活检样本中幽门螺杆菌的辅助观察与初步判读。

1.2 方法原理

（1）MGG 法属于 Romanowsky 类染色体系，通过 May-Grünwald 工作液与 Giemsa 工作液的顺序染色，使组织成分与细菌结构形成较稳定的综合色差异。

（2）幽门螺杆菌在该体系中多呈蓝色，便于在胃黏液层、胃小凹及上皮表面区域进行定位观察。

（3）细胞核、胃黏膜上皮、胶原纤维及红细胞在染色后呈现不同色调，有助于背景组织与目标菌体的区分。

1.3 染色质量要求

（1）幽门螺杆菌着色清楚，轮廓可辨。

（2）胃黏膜背景组织分色自然，细胞核显示完整。

（3）切片背景较干净，无明显染液沉积和大片脱色。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）胃黏膜石蜡组织切片。

（2）胃镜活检组织石蜡切片。

2.2 主要试剂

（1）10% 福尔马林固定液。

（2）May-Grünwald 工作液。

（3）Giemsa 工作液。

（4）蒸馏水。

（5）无水乙醇。

（6）二甲苯或脱蜡透明液。

（7）中性树胶。

2.3 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）染色缸或滴染操作平台。

（3）石蜡切片机。

（4）镊子、吸水纸。

（5）显微镜。

3 染液与样本准备

3.1 固定要求

（1）组织固定于 10% 福尔马林。

（2）固定后按常规流程完成脱水、包埋。

（3）同批样本宜保持固定条件一致，以减少染色差异。

3.2 切片要求

（1）石蜡切片厚度为 4 μm。

（2）切片应附着牢固，避免滴染过程中脱片。

（3）切片厚薄应尽量一致，以提高结果可比性。

3.3 染液要求

（1）May-Grünwald 工作液须于临用前配制，不宜久置。

（2）Giemsa 工作液须于临用前配制，不宜保存。

（3）试剂开封后应尽快使用，以免影响后续染色效果。

4 实验流程

4.1 固定、包埋与脱蜡

（1）组织固定于 10% 福尔马林后，常规脱水、包埋。

（2）石蜡切片厚 4 μm。

（3）常规二甲苯或脱蜡透明液脱蜡至水。

（4）再用蒸馏水洗 1 次。

4.2 May-Grünwald 染色

（1）将切片周围多余水分轻轻吸干，但不使组织表面完全失水。

（2）向切片上滴加适量 May-Grünwald 工作液，确保覆盖组织区域。

（3）染色 10 min。

（4）染色结束后倾去染液，不必长时间冲洗。

4.3 Giemsa 染色

（1）于同一切片上滴加 Giemsa 工作液，覆盖全部组织区域。

（2）染色 20 min。

（3）染色结束后倾去染液。

4.4 脱水、透明与封片

（1）用无水乙醇快速洗去余液。

（2）乙醇处理后稍烤干或自然短时干燥。

（3）转入二甲苯或脱蜡透明液中透明。

（4）滴加中性树胶并覆盖盖玻片，完成封固。

5 染色结果

5.1 目标菌体

（1）胃幽门螺杆菌呈蓝色。

5.2 背景组织

（1）胶原纤维呈红色。

（2）红细胞呈绿色。

（3）胃黏膜上皮呈淡蓝色。

（4）细胞核呈深蓝色。

6 结果判读要点

6.1 菌体定位

（1）幽门螺杆菌多位于胃黏液层、胃小凹表面或上皮邻近区域。

（2）观察时应重点关注胃表面黏液层与腺窝开口附近区域。

6.2 菌体形态

（1）染色良好时，菌体可见细小弯曲、短杆状或轻度螺旋状轮廓。

（2）菌量较少时，应在低倍定位后转高倍细查黏液层边缘。

6.3 背景判读

（1）胃黏膜上皮与核染色应较清楚，以便与细菌沉积物区分。

（2）若背景过深或杂色明显，可影响菌体识别，应结合染色均一性综合判断。

7 常见问题与原因分析

7.1 菌体显示不清或着色偏浅

（1）Giemsa 工作液染色时间不足。

（2）染液临用前配制不充分或已放置过久。

（3）组织中菌量较少，需扩大观察范围。

7.2 切片整体脱色

（1）无水乙醇洗涤时间过长。

（2）透明前处理过强，导致目标菌体颜色流失。

（3）MGG 法最后无水乙醇步骤应速洗，不宜延长。

7.3 背景染色过重

（1）May-Grünwald 或 Giemsa 染色时间过长。

（2）切片周围水分未处理好，导致局部染液浓度不均。

（3）染液老化或配制状态不稳定。

7.4 染色不均或局部沉积

（1）切片脱蜡不充分。

（2）切片表面残留水分不均。

（3）染液覆盖不完全或切片表面有污染。

8 应用范围

8.1 胃黏膜活检样本观察

（1）用于胃黏膜组织中幽门螺杆菌的辅助显示。

（2）适用于胃炎、胃黏膜损伤及相关活检标本的病理观察辅助。

8.2 常规组织学筛查

（1）适用于石蜡切片中疑似幽门螺杆菌感染的初步筛查。

（2）可作为 HE 染色后进一步专项观察的补充方法。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并戴一次性手套操作。

（2）处理染液、乙醇和二甲苯时应在通风条件良好的环境下进行。

9.2 操作注意事项

（1）May-Grünwald 工作液和 Giemsa 工作液须于临用前配制，不宜保存。

（2）最后的无水乙醇需快速洗去余液，否则容易脱色。

（3）幽门螺杆菌在部分情况下仅用 Giemsa 工作液也可显示，但 MGG 法通常更利于组织背景与菌体的综合色分辨。

9.3 废液处理

（1）染色废液、乙醇及二甲苯废液应分类收集。

（2）所有污染耗材应按实验室化学品及病理样本处理规范处置。

10 相关试剂与材料选型

表1 幽门螺杆菌May-Grünwald-Giemsa（MGG）染色相关试剂选型

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[1] 涂片染色、微生物学染色与基础染料体系的原理与方法