将生物素化蛋白质和DNA从链霉亲和素微珠上洗脱通常需要较为严苛的条件，如酶促消化、极端 pH、有机溶剂，或在过量生物素存在下加热。应选择何种洗脱方式，取决于具体生物素化分子的性质以及其后续应用场景。

         链霉亲和素是一种来源于细菌的蛋白质，可与小分子生物素形成极其紧密的结合；这种相互作用被认为是天然蛋白与其配体之间最强的非共价结合之一（Sano 等, 1998）。得益于这一特性，链霉亲和素已被广泛用作生物素化分子的固相载体，用于固定和纯化生物素化蛋白质或核酸。

         然而，正因为链霉亲和素–生物素结合过于牢固，一旦生物素化分子被捕获在链霉亲和素微珠上，就很难将其洗脱下来。实际操作中，高效洗脱往往需要采用较为苛刻的条件，例如酶切、极端 pH、有机溶剂处理，或在过量生物素存在下对体系加热。如何在这些方法中进行选择，需要综合考虑目标分子的稳定性以及后续实验对其结构和活性的要求。

         本文将结合图1，介绍研究人员常用的几种从链霉亲和素微珠上洗脱生物素化分子的方法，并帮助根据具体实验需求选择合适的洗脱策略。

图1 生物素化蛋白与偶联在琼脂糖微珠上的链霉亲和素结合

如何洗脱生物素化蛋白质

当生物素分子通过共价键连接到赖氨酸侧链上时，该蛋白即被认为是“生物素化”蛋白。可以利用酶在Avi标签中的某一个特定赖氨酸残基上实现位点特异性的生物素化（图2 左）（Fairhead & Howarth, 2015）。另一种方式是通过化学反应，在蛋白质分子内多个赖氨酸残基上进行多位点生物素化，从而实现更广泛的标记（图2 右）（Kay 等, 2009）。

图2 蛋白质的位点特异性与多位点生物素化。蛋白质可在Avi标签上实现位点特异性生物素化（左），也可在分子内多个赖氨酸残基上进行多位点生物素化（右）。

         链霉亲和素与生物素之间极强的相互作用，使得可以以高度特异性的方式对生物素化蛋白进行纯化或固定。常用的生物素化蛋白洗脱策略包括：

(1) 酶促消化

(2) 酸性缓冲液洗脱

(3) 表面活性剂联合加热处理

（1）酶促消化

         将生物素化蛋白从链霉亲和素微珠上释放下来的一种方法，是在不破坏生物素–链霉亲和素相互作用的前提下，将蛋白质主体从生物素化部分上切除。具体做法可以是：利用特异性酶切位点，切断生物素化标签与蛋白主体之间的连接肽段；也可以使用非特异性蛋白酶，将蛋白质水解成较小片段（见图3）。

 ​​​​图3 将蛋白质从链霉亲和素微珠上切除。对于位点特异性生物素化的蛋白，可用特异性蛋白酶（蓝色剪刀）切除生物素化标签，从而将完整蛋白从链霉亲和素微珠上释放出来（左）。对于多位点生物素化的蛋白，则使用非特异性蛋白酶（粉色剪刀）将蛋白切割成许多小片段（右），其中不再带有生物素标记的片段会从链霉亲和素微珠上洗脱。

通过特异性切断生物素化标签与蛋白主体之间的连接臂，可以洗脱出全长且具有功能活性的蛋白质，可用于多种不同的后续应用。相反，如果将结合在微珠上的蛋白质切割成许多小片段，则会洗脱出一系列肽段混合物。后一种策略在基于质谱的蛋白质分析中应用广泛，因为这些小肽段仍然足以支持蛋白质鉴定。对于需要获得完整蛋白的其他实验，更适合采用带有可切连接臂的标签，或选择后文将要介绍的其他洗脱方式。

（2）酸性缓冲液

         强酸性缓冲液可以破坏生物素与链霉亲和素之间的相互作用，因此常用于洗脱生物素化蛋白。典型的酸性洗脱缓冲液包括：

(1) 6 M 盐酸胍（guanidine HCl）

(2) 0.1 M 醋酸（acetic acid）

(3) 0.1 M 甘氨酸盐酸缓冲液（glycine HCl）

         需要注意的是，如此酸性的条件同样会破坏大多数蛋白质的整体构象和活性，因此应尽快将洗脱液的pH调回接近中性。通常可加入高浓度Tris或其他适宜的碱性试剂进行中和，并应在洗脱后尽早完成这一操作。

（3）表面活性剂与加热

         最后一种策略是联合使用表面活性剂和加热来破坏生物素–链霉亲和素相互作用，从而将生物素化蛋白从链霉亲和素微珠上洗脱下来。

         一种较为“严苛”的做法，是直接向链霉亲和素微珠中加入SDS-PAGE上样缓冲液，对样品进行煮沸处理，然后将上清液上样进行电泳。该方法通常用于后续本就需要进行SDS-PAGE分析的情况。由于条件非常强烈，不仅生物素化蛋白会被洗脱，链霉亲和素本身也会从微珠上脱落。

         也有研究团队尝试建立一种更温和的“表面活性剂 + 加热”洗脱方案，使只有生物素化蛋白被洗脱，而链霉亲和素仍然保留在微珠上。这在那些对链霉亲和素污染较为敏感的实验（例如检测低丰度蛋白）中尤为重要。他们优化得到的洗脱缓冲液配方为：0.4% SDS、1% IGEPAL-CA630（非离子型表面活性剂）和25 mM生物素，并在95 °C加热5分钟（Cheah 和 Yamada, 2017）。作为对比，常规SDS-PAGE上样缓冲液中SDS含量一般为 2%。

         该方法的另一大优点是链霉亲和素在此条件下仍然保持活性，因此在经过适当评估后，链霉亲和素微珠还可以重复使用。相反，更为严苛的洗脱方式（例如非特异性酶促消化或使用SDS-PAGE上样缓冲液处理）通常会不可逆地破坏链霉亲和素微珠，使其无法再用于后续纯化。

如何洗脱生物素化核酸

         在讨论了生物素化蛋白质的洗脱方法之后，我们接下来看看生物素化核酸的洗脱策略。核酸常通过生物素化来便于纯化，以用于后续的DNA测序，以及结构与功能等方面的研究。常见的生物素化核酸洗脱方法包括：

(1) 碱性缓冲液联合加热

(2) 纯水联合加热

(3) 有机溶剂萃取

（1）碱性缓冲液与加热

         已有研究表明，在较高温度下使用氢氧化铵可以高效地将生物素化DNA从链霉亲和素上洗脱（Jurinke 等，1997）。然而，这种强碱性处理同样会损伤DNA碱基。因此，对于几乎所有后续应用而言，这种方法通常并不适用，应尽量避免，而优先考虑下文介绍的更温和洗脱策略。

（2）纯水与加热

         另一种选择是在纯水中、温度高于70 °C时，使生物素高效地从链霉亲和素上解离。与上述强碱性条件不同，这种洗脱方式不会损伤DNA碱基（Holmberg 等，2005）。

         然而，溶液中常见的缓冲组分（如盐类和pH缓冲剂）会显著降低该方法的生物素洗脱效率。因此，大多数直接来源于生物样品的 DNA 无法直接采用这种方式洗脱，通常需要增加一步中间缓冲置换，将体系预先更换为纯水。

（3）有机溶剂萃取

         使用加热方式洗脱生物素化核酸的另一个限制在于，高温会破坏碱基配对，从而使核酸双链解链（见图4）。对于许多后续应用（例如测序）而言，这通常不成问题，因为在实验流程后续步骤中，这些碱基配对本来也会被打断。

         但对于那些需要核酸保持天然构象和碱基配对状态的实验，则应尽量避免使用高温条件。

图4 加热会破坏核酸碱基配对。 对于需要保持核酸天然构象的后续应用，在洗脱步骤中应尽量避免使用高温条件。

       经典的酚/氯仿抽提法常用于将核酸从复杂生物样品中分离出来（Sambrook 和 Russell, 2006），同样也可用于将DNA从链霉亲和素微珠上洗脱。在此条件下，样品中的所有蛋白质——包括结合在微珠上的链霉亲和素——都会发生变性，因此在完成抽提后不应再重复使用这些琼脂糖微珠。相比之下，核酸的结构及其碱基配对相互作用在该过程中得以保留，而生物素基团也仍然具有功能，可在本次洗脱之后继续用于后续步骤（Bearden 等, 2019）。

         以上内容涵盖了多种常用的从链霉亲和素微珠上洗脱生物素化蛋白质和核酸的方法。实际选择哪种策略，需根据待处理分子的类型、生物素化方式以及该生物素化分子的后续用途进行认真权衡。

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参考文献

1. Sano T, Vajda S, Cantor CR. Genetic engineering of streptavidin, a versatile affinity tag. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1998;715(1):85–91. doi:10.1016/S0378-4347(98)00316-8.

2. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171–184. doi:10.1007/978-1-4939-2272-7_12.

3. Kay BK, Thai S, Volgina VV. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol Biol. 2009;498:185–196. doi:10.1007/978-1-59745-196-3_13.

4. Cheah JS, Yamada S. A simple elution strategy for biotinylated proteins bound to streptavidin conjugated beads using excess biotin and heat. Biochem Biophys Res Commun. 2017;493(4):1522–1527. doi:10.1016/j.bbrc.2017.09.168.

5. Jurinke C, van den Boom D, Collazo V, Lüchow A, Jacob A, Köster H. Recovery of nucleic acids from immobilized biotin–streptavidin complexes using ammonium hydroxide and applications in MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 1997;69(5):904–910. doi:10.1021/ac960879u.

6. Holmberg A, Blomstergren A, Nord O, Lukacs M, Lundeberg J, Uhlén M. The biotin–streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures. Electrophoresis. 2005;26(3):501–510. doi:10.1002/elps.200410070.

7. Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

8. Bearden S, Wang F, Hall AR. Simple and efficient room-temperature release of biotinylated nucleic acids from streptavidin and its application to selective molecular detection. Anal Chem. 2019;91(13):7996–8001. doi:10.1021/acs.analchem.9b01873.

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