1. 单木质醇的单电子氧化与酚氧自由基形成

         单木质醇的氧化偶联以酚类前体形成自由基为起点。松柏醇（coniferyl alcohol）是木脂素氧化偶联研究中的经典模型底物，其芳环含4位酚羟基和3位甲氧基，侧链与芳环保持共轭。漆酶、过氧化物酶等氧化体系均可使松柏醇发生单电子氧化，形成共振稳定的酚氧自由基。[1–3]

         不同氧化体系的电子受体并不相同。漆酶利用分子氧完成氧化还原循环，过氧化物酶通常依赖过氧化氢；两者产生的松柏醇自由基均可进入后续自由基偶联。[3] 在经典松柏醇体外反应中，氧化步骤建立自由基反应性，具体成键位置和空间取向则在随后的偶联过程中形成。Ando等对单木质醇氧化的总结也显示，单电子氧化后的松柏醇自由基能够通过多种区域连接发生二聚。

         定向蛋白（dirigent protein，DIR）参与的是自由基形成之后的选择性控制。经典DIR实验中，氧化酶负责生成松柏醇自由基，而DIR本身缺乏相应的氧化活性。[1]

2. 酚氧自由基的共振离域与偶联位点

2.1 O4、C5和C8的自由基反应性

         松柏醇失去一个电子后形成的自由基具有明显的共振离域特征。未成对电子并非局限于酚氧原子，而可通过芳氧基、芳环以及与芳环共轭的侧链重新分布。与主要二聚反应相关的自由基反应位点包括酚氧O4、芳环C5以及侧链C8。[3,4]

         这些共振式属于同一个离域自由基的不同极限表示。木质素化学通常将松柏醇侧链三个碳标记为α、β和γ，分别对应木脂素编号中的C7、C8和C9。因此，相关文献中的β–β、β–5和β–O–4偶联分别对应C8–C8′、C8–C5′和C8–O–C4′成键。

         在木质化过程中，单木质醇自由基除可相互二聚外，还可与生长中的寡聚木质素自由基发生交叉偶联。以松柏醇为例，单木质醇二聚可形成β–O–4、β–5和β–β连接；单木质醇与寡聚木质素的端向交叉偶联主要形成β–O–4和β–5连接，而两个寡聚木质素自由基之间还可形成5–5和4–O–5连接。[3] 这些反应共同体现了酚类自由基经不同反应位点发生区域偶联的化学基础。

图1 松柏醇单电子氧化、酚氧自由基共振离域及自由基偶联。 松柏醇经单电子氧化形成共振稳定的酚氧自由基；两个单木质醇自由基可经β–O–4、β–5和β–β等方式偶联，分别形成β-醚、二氢苯并呋喃型和树脂醇型结构。原图同时展示了单木质醇与寡聚木质素以及寡聚木质素之间的自由基交叉偶联。图中采用木质素化学的α/β/γ侧链编号，其中β对应木脂素编号中的C8。图源：Ando等[3]，Figure 1A，CC BY 3.0。

2.2 电子结构、取代模式与偶联倾向

         密度泛函理论（density functional theory，DFT）计算比较了单木质醇自由基的多种初始二聚方式。在所研究的六种主要连接中，8–O–4、8–8和8–5偶联具有较有利的反应焓；在交叉偶联计算中，较活泼自由基倾向于通过自旋密度较高的位置参与成键。[4]

         自由基共振离域提供可参与反应的成键位置，自旋密度和反应能影响各位置的相对反应性；芳环取代、空间位阻、两个自由基的接近方向以及局部介质进一步改变各偶联通道之间的竞争。例如，松柏醇的C5保留氢原子，可以参与8–5′偶联；芥子醇的相应C5位被甲氧基占据，其可利用的区域偶联方式随取代状态发生变化。

3. 8–8′、8–5′与8–O–4′偶联的区域选择性

         区域选择性由初始自由基偶联时形成新键的原子位置确定。松柏醇自由基的8–8′、8–5′和8–O–4′偶联分别建立C8–C8′、C8–C5′和C8–O–C4′新键；这些初始成键之后通常还伴随醌甲基中间体的亲核捕获、环化或重芳构化，形成稳定的二聚结构。[3,5–7]

         按IUPAC结构分类，8–8′连接的二聚体属于木脂素；8–5′等非8–8′ C–C连接产物属于新木脂素；仅通过醚氧连接两个C₆–C₃单元的8–O–4′型则属于氧新木脂素。本文为比较单木质醇自由基偶联的区域选择性，将三类连接并列讨论。

3.1 8–8′偶联与双醌甲基形成

         两个松柏醇自由基均通过C8参与成键时，直接建立C8–C8′键。初始偶联后两个芳香单元均具有醌甲基性质，形成双醌甲基中间体（bis-quinone methide，bisQM）。该中间体保留两条侧链末端羟基，可继续发生分子内亲核环化，最终形成松脂醇。[7,10]

         8–8′体系也是目前DIR控制机理研究较深入的木脂素氧化偶联实例。Forsythia来源DIR以及拟南芥AtDIR6均可使松柏醇自由基的反应明显偏向8–8′偶联，并进一步产生特定的松脂醇对映体。[1,8–10]

3.2 8–5′偶联与二氢苯并呋喃环形成

         一个松柏醇自由基的C8与另一自由基的C5′形成C–C键后生成醌甲基中间体。随后，参与C5′连接的芳环上的O4′酚氧对醌甲基C7发生分子内亲核进攻，形成C7–O4′键并恢复芳香性，由此形成2,3-二氢苯并呋喃环。

         脱氢二松柏醇是这一反应序列的典型产物。其结构由C8–C5′自由基偶联和随后C7–O–C4′环化共同建立：第一步决定两个单元的区域连接，第二步形成含氧五元环。

3.3 8–O–4′偶联与醌甲基的亲核捕获

         8–O–4′偶联由一个松柏醇自由基的C8与另一个自由基的O4′成键，直接形成单元间C–O连接。所得醌甲基中间体在C7具有亲电性，随后可接受水或其他亲核体进攻并恢复芳香性。水加成可形成相应的愈创木基甘油-8-O-4′-松柏醇醚。

         反应介质能够明显改变不同偶联通道及醌甲基捕获反应之间的竞争。Quideau和Ralph以Ag₂O氧化松柏醇时，在二氯甲烷中获得较高比例的β–5偶联脱氢二松柏醇；加入等体积水后，β–β偶联生成的松脂醇成为主要二聚产物。对于β–O–4形成的醌甲基，酚类亲核体可与水竞争，而酸催化条件增强水加成。[5]

         植物细胞实验也显示三种区域偶联均具有生物学相关性。Beejmohun等向亚麻细胞悬浮培养物提供[^13C₂]松柏苷，标记进入8–8′连接的落叶松脂醇双葡萄糖苷、8–5′连接的脱氢二松柏醇葡萄糖苷以及8–O–4′连接的愈创木基甘油-松柏醇醚葡萄糖苷，表明同一类单木质醇前体能够进入不同区域连接的二聚产物。[6]

4. 醌甲基中间体与自由基偶联后的结构转化

4.1 醌甲基的亲电性与重芳构化

         自由基-自由基偶联形成新的σ键后，产物常暂时包含一个或两个醌甲基结构。醌甲基中的芳香体系被转化为环己二烯酮型共轭体系，同时在苄位C7形成明显的亲电反应中心。亲核体向C7加成后恢复芳香体系，芳构化所带来的π电子稳定化为后续反应提供重要驱动力。[7,10]

         不同区域偶联产生的醌甲基具有不同的空间关系和可利用亲核基团，因此后续结构转化存在差异：8–O–4′体系可接受外部亲核体；8–5′体系能够发生分子内酚氧环化；8–8′体系同时形成两个醌甲基片段，可连续发生两次分子内环化。

4.2 双醌甲基向松脂醇的环化

         8–8′偶联产生的bisQM中，C7和C7′均具有亲电性。两个侧链末端C9/C9′羟基分别作为分子内亲核体进攻C7/C7′，通过1,6-加成建立两条C–O键，同时完成两个芳环的重芳构化，最终形成松脂醇的双四氢呋喃结构。[7,10]

         图2 双醌甲基中间体向松脂醇环化的反应过程。 末端羟基对bisQM的C7/C7′进行分子内亲核加成，形成含氧环并伴随环己二烯酮重芳构化。酸催化可以通过质子化增强C7的亲电性，氢键作用则可增加C7的部分正电性，从而促进亲核进攻。图源：Gasper等[10]，Figure 2，CC BY 4.0。

5. 区域选择性与立体选择性的反应层级

         自由基偶联的选择性包括成键位置和空间取向两个主要层级。区域选择性规定形成哪一对原子之间的新键；在给定连接方式下，自由基的接近面和后续中间体构象进一步产生对映选择性或非对映选择性。

         在松柏醇8–8′偶联中，区域选择性将新键限定为C8–C8′。在这一连接方式内，两个自由基仍可采取不同的成键面：re–re偶联形成S,S构型的bisQM，并通向(−)-松脂醇；si–si偶联形成R,R构型的bisQM，并通向(+)-松脂醇。[10]

         区域选择性与对映选择性存在结构上的联系，但两者受到的蛋白约束并不完全相同。AtDIR6的F47A/Y118A双突变体仍保留约25%的野生型区域选择性，却基本失去对(−)-松脂醇的对映偏好，说明维持C8–C8′优先成键所需的空间约束，与进一步固定自由基成键面所需的相互作用可以部分分离。[10]

6. DIR介导的8–8′区域选择性与对映选择性

6.1 自由基生成与DIR作用的分工

         Davin等研究松柏醇氧化偶联时发现，单独使用氧化酶可形成脱氢二松柏醇、松脂醇和愈创木基甘油-8-O-4′-松柏醇醚等混合二聚产物，其中松脂醇呈外消旋状态；加入Forsythia属植物来源的DIR蛋白组分后，反应显著集中到8–8′偶联，并形成高度对映富集的(+)-松脂醇。[1] DIR蛋白自身缺乏催化单电子氧化所需的活性中心，其功能位于松柏醇自由基生成之后。[1]

         Halls等进一步比较了未氧化松柏醇与松柏醇自由基参与DIR反应的动力学特征。未氧化松柏醇与DIR的平衡解离常数 KD 为370 ± 65 μM；根据DIR途径与开放溶液自由基偶联相竞争的动力学模型，针对稳态松柏醇自由基浓度估算的表观 KM 约为10 nM。实验结果支持松柏醇自由基而非未氧化松柏醇作为DIR反应底物的机制。[2]

         电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）研究又提供了自由基证据。Modolo等观察到AtDIR6能够稳定瞬态松柏醇自由基，随后使反应偏向形成(−)-松脂醇，与自由基先被DIR结合和稳定、再进行定向偶联的机制一致。[11]

6.2 不同DIR产生相反的对映选择性

         DIR对松脂醇形成的控制不仅表现为8–8′区域选择，还包括具体的对映方向。

         Forsythia来源FiDIR1使反应偏向(+)-松脂醇。Pickel等鉴定的拟南芥AtDIR6则具有相反的对映选择性，在其体外漆酶偶联体系中形成78%对映体过量〔enantiomeric excess，ee〕的(−)-松脂醇；缺少DIR时松脂醇保持外消旋。[8]

         Kim等随后通过拟南芥DIR蛋白的体外反应、过表达和RNA干扰实验进一步支持AtDIR6在(−)-松脂醇形成中的生理作用，并证实五味子属DIR可表现出相反的(+)-松脂醇选择性。[9]

         相同的松柏醇自由基和相同的C8–C8′连接由此可以产生相反的对映结果，差异来自蛋白对两个自由基相对空间取向的约束。

6.3 AtDIR6双口袋对两个自由基的空间预组织

         早期动力学模型曾提出两个松柏醇自由基分别结合于DIR二聚体的两个亚基。后续DIR晶体结构显示蛋白以三聚体存在，不同亚基的潜在结合位点相距过远，难以完成自由基间偶联；AtDIR6结构研究因此提出两个自由基同时结合于同一单体的双叶形活性腔，并在单个结合位点内完成定向偶联。[2,10]

         Gasper等获得了拟南芥AtDIR6的1.4 Å晶体结构。AtDIR6单体具有八股反平行β-桶结构，并组成三聚体；每个单体的开放端形成一个双叶形结合腔，其中包含相邻的口袋A和口袋B。[10]

         口袋A含Asp-137、Arg-144和Thr-166等功能相关残基，口袋B含Asp-49、Lys-75、Tyr-104和Tyr-106等残基。以体积较大的色氨酸分别阻断口袋A或口袋B均使AtDIR6活性显著下降，支持两个口袋共同参与反应底物的定位。[10]

         研究者将两个松柏醇自由基分别手动置入口袋A和B，再通过模拟退火和能量最小化优化结构。优化后的两个自由基使C8和C8′相互接近，形成与AtDIR6所需8–8′、re–re偶联相容的空间排列。[10]

         图3 AtDIR6活性位点的双口袋结构及两个松柏醇自由基的潜在结合模式。 左上图显示AtDIR6单体表面的双叶形活性腔及口袋A和口袋B；右上图为旋转90°后的活性腔切面，显示两个口袋的内部结构。左下图显示两个口袋中的重要氨基酸残基，其中口袋A残基以绿色表示，口袋B残基以蓝色表示，Tyr106和Phe175以红色表示。右下图显示两个松柏醇自由基（CA·）手动置入口袋后，经模拟退火优化和能量最小化获得的潜在结合模式；模型中C8和C8′相互接近，几何排列与re–re面8–8′偶联相容。该结合模式基于无配体AtDIR6晶体结构建立。图源：Gasper等[10]，Figure 3，CC BY 4.0。

         在该结构模型中，芳香环在两个口袋中的定位减少了两个自由基可利用的相对取向，使C8–C8′成键获得区域优势；侧链在有限空间中的具体排列则有助于确定自由基的成键面。AtDIR6的结合腔结构、底物建模和定点突变结果共同支持蛋白通过对成键原子位置和成键面的空间约束产生区域选择性与对映选择性。

6.4 AtDIR6对bisQM环化的潜在催化作用

         AtDIR6的结构与突变结果还支持其参与8–8′偶联后的环化步骤。口袋A中的Asp-137、Arg-144、Thr-166以及口袋B中的Asp-49、Tyr-104和Tyr-106均与蛋白活性密切相关；多个残基突变会明显降低区域选择性、对映选择性或总体反应活性。[10]

         Gasper等提出，Asp等酸性残基及邻近氢键网络可通过羰基质子化或氢键作用提高bisQM中C7/C7′的亲电性，促进末端羟基进行分子内亲核进攻。能量最小化后的bisQM模型也能够以适合环化的构象容纳在AtDIR6活性腔内。

         这一催化机理目前由AtDIR6无配体晶体结构、底物和中间体结构建模以及定点突变实验共同支持；底物自由基或bisQM与AtDIR6的高分辨率复合物结构仍可进一步确定具体的质子转移和环化路径。[10]

6.5 不同偶联方式中的蛋白选择性控制

         目前较完整的结构和动力学机制证据集中在松柏醇自由基8–8′偶联形成松脂醇的DIR体系。8–5′和8–O–4′自由基偶联具有明确的化学基础，并可在植物细胞中形成相应产物，但这些连接在不同植物中的具体蛋白调控方式需要依据各自的生化和遗传证据判定。

         植物天然产物中还存在由细胞色素P450、漆酶或过氧化物酶直接实现区域或立体控制的其他酚类偶联反应。[10] DIR由此代表植物控制自由基空间偶联的一类重要机制，而不同底物和不同连接类型可以采用不同的选择性控制方式。

7. 下游还原酶对立体信息的继续加工

7.1 松脂醇/落叶松脂醇还原酶的连续还原

         自由基偶联和bisQM环化形成松脂醇以后，已有的立体结构还会影响下游酶反应。松脂醇/落叶松脂醇还原酶（pinoresinol/lariciresinol reductase，PLR）是这一阶段研究较清楚的代表。

Forsythia intermedia来源的PLR利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）提供氢负离子，连续催化：

         (+)-松脂醇 → (+)-落叶松脂醇 → (−)-开环异落叶松脂醇

         这一过程依次还原松脂醇的两个苄基醚结构，使双四氢呋喃型结构逐步开环。[12]

7.2 氢负离子转移的立体专一性

         同位素标记实验显示，Forsythia PLR催化的两个氢负离子转移步骤均表现出大于99%的立体专一性。NADPH烟酰胺环C4上的pro-R氢被选择性转移，进入落叶松脂醇和开环异落叶松脂醇的特定空间位置。[12]

         DIR与PLR作用在不同反应阶段。DIR在松脂醇形成之前约束自由基的区域连接和成键面；PLR识别已经形成的木脂素立体结构，并进行立体专一的还原转化。植物木脂素的空间选择性由此可以在连续反应步骤中得到保持和进一步筛选。

         松柏醇的单电子氧化首先产生共振离域的自由基，O4、C5和C8等反应位点赋予自由基多种区域偶联可能。8–8′、8–5′和8–O–4′成键形成不同的醌甲基中间体，随后通过分子内环化或亲核捕获形成稳定二聚结构。松脂醇体系中，DIR对两个松柏醇自由基进行空间预组织，使8–8′成键及特定成键面获得明显优势；bisQM的后续环化和PLR的立体专一还原则继续传递和加工这一立体信息。自由基的电子结构提供多种成键可能，蛋白结合位点和下游酶的三维约束则使其中部分反应获得明确的区域和立体选择性。

8. 单木质醇氧化偶联、区域与立体选择性及下游转化相关代表化学品

表1 单木质醇自由基前体与糖苷型前体

表2 区域偶联、对映选择性及下游立体选择性转化产物

表3 单电子氧化与下游还原反应体系相关试剂

         注：以上为阿拉丁代表性科研相关产品，具体用途应结合产品规格、批次COA及目标反应或评价体系确定。更多产品规格、级别和COA信息可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。

参考文献

[1] Davin LB, Wang HB, Crowell AL, Bedgar DL, Martin DM, Sarkanen S, Lewis NG. Stereoselective bimolecular phenoxy radical coupling by an auxiliary (dirigent) protein without an active center. Science. 1997;275(5298):362–366. doi:10.1126/science.275.5298.362.

[2] Halls SC, Davin LB, Kramer DM, Lewis NG. Kinetic study of coniferyl alcohol radical binding to the (+)-pinoresinol forming dirigent protein. Biochemistry. 2004;43(9):2587–2595. doi:10.1021/bi035959o.

[3] Ando D, Lu F, Kim H, Eugene A, Tobimatsu Y, Vanholme R, Elder TJ, Boerjan W, Ralph J. Incorporation of catechyl monomers into lignins: lignification from the non-phenolic end via Diels–Alder cycloaddition? Green Chemistry. 2021;23:8995–9013. doi:10.1039/D1GC03022A.

[4] Sangha AK, Parks JM, Standaert RF, Ziebell A, Davis M, Smith JC. Radical coupling reactions in lignin synthesis: a density functional theory study. Journal of Physical Chemistry B. 2012;116(16):4760–4768. doi:10.1021/jp2122449.

[5] Quideau S, Ralph J. A biomimetic route to lignin model compounds via silver(I) oxide oxidation. 1. Synthesis of dilignols and non-cyclic benzyl aryl ethers. Holzforschung. 1994;48(1):12–22. doi:10.1515/hfsg.1994.48.1.12.

[6] Beejmohun V, Fliniaux O, Hano C, Pilard S, Grand E, Lesur D, et al. Coniferin dimerisation in lignan biosynthesis in flax cells. Phytochemistry. 2007;68(22–24):2744–2752. doi:10.1016/j.phytochem.2007.09.016.

[7] Ralph J, Schatz PF, Lu F, Kim H, Akiyama T, Nelsen SF. Quinone methides in lignification. In: Rokita SE, ed. Quinone Methides. Hoboken: John Wiley & Sons; 2009:385–420. doi:10.1002/9780470452882.ch12.

[8] Pickel B, Constantin MA, Pfannstiel J, Conrad J, Beifuss U, Schaller A. An enantiocomplementary dirigent protein for the enantioselective laccase-catalyzed oxidative coupling of phenols. Angewandte Chemie International Edition. 2010;49:202–204. doi:10.1002/anie.200904622.

[9] Kim KW, Moinuddin SGA, Atwell KM, Costa MA, Davin LB, Lewis NG. Opposite stereoselectivities of dirigent proteins in Arabidopsis and Schizandra species. Journal of Biological Chemistry. 2012;287(41):33957–33972. doi:10.1074/jbc.M112.387423.

[10] Gasper R, Effenberger I, Kolesinski P, Terlecka B, Hofmann E, Schaller A. Dirigent protein mode of action revealed by the crystal structure of AtDIR6. Plant Physiology. 2016;172(4):2165–2175. doi:10.1104/pp.16.01281.

[11] Modolo C, Ren L, Besson E, Robert V, Gastaldi S, Rousselot-Pailley P, Tron T. Coniferyl alcohol radical detection by the dirigent protein AtDIR6 monitored by EPR. ChemBioChem. 2021;22(6):992–995. doi:10.1002/cbic.202000650.

[12] Chu A, Dinkova A, Davin LB, Bedgar DL, Lewis NG. Stereospecificity of (+)-pinoresinol and (+)-lariciresinol reductases from Forsythia intermedia. Journal of Biological Chemistry. 1993;268(36):27026–27033. doi:10.1016/S0021-9258(19)74213-6.

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