1 概述

1.1 目的与适用范围

       本规程用于建立间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外成骨诱导及分化鉴定流程，适用于骨髓、脂肪和脐带等来源MSCs的成骨分化研究。不同来源、供体及培养代次的MSCs分化能力可能存在差异，正式实验前应进行条件预验证。

1.2 方法原理

       在地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸盐共同作用下，MSCs可逐步向成骨细胞分化。抗坏血酸促进胶原基质形成，β-甘油磷酸盐提供矿化所需磷酸根，地塞米松参与成骨相关基因表达调控。

       成骨分化早期可通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性或染色进行评价；分化中后期可通过茜素红S染色显示钙盐沉积和矿化结节。

2 材料与试剂

2.1 细胞

（1）骨髓来源MSCs。

（2）脂肪来源MSCs。

（3）脐带来源MSCs。

       建议使用生长状态良好、无支原体污染且分化潜能稳定的细胞。

2.2 主要试剂

（1）0.1%明胶包被液。

（2）MSC完全培养基。

（3）α-MEM培养基。

（4）胎牛血清（FBS）。

（5）青霉素-链霉素溶液（P/S）。

（6）抗坏血酸。

（7）β-甘油磷酸盐。

（8）地塞米松。

（9）胰蛋白酶细胞消化液。

（10）PBS。

（11）ALP染色或活性检测试剂。

（12）4%多聚甲醛固定液。

（13）茜素红S染色液。

2.3 成骨诱导培养基

       以α-MEM为基础培养基，加入下列成分：

（1）10%FBS。

（2）1%P/S。

（3）抗坏血酸，终浓度0.05mM。

（4）β-甘油磷酸盐，终浓度10mM。

（5）地塞米松，终浓度100nM。

       培养基宜现用现配或分装低温保存，避免反复冻融。

2.4 主要器材

（1）6孔细胞培养板。

（2）CO₂培养箱。

（3）倒置显微镜。

（4）离心机。

（5）细胞计数仪或血球计数板。

3 实验分组

3.1 成骨诱导组

       细胞使用成骨诱导培养基培养。

3.2 未诱导对照组

       细胞使用不含抗坏血酸、β-甘油磷酸盐和地塞米松的标准完全培养基培养。

3.3 重复设置

       每组建议至少设置3个复孔，并保证不同组细胞来源、代次、接种密度和培养时间一致。

4 实验流程

4.1 培养板包被

（1）向6孔板中加入适量0.1%明胶包被液，使液体完全覆盖孔底。

（2）室温孵育30min。

（3）吸弃包被液，避免孔底长时间干燥。

4.2 细胞消化与收集

（1）选择融合度约85%的MSCs。

（2）弃去原培养基，以PBS轻洗细胞。

（3）加入适量胰蛋白酶细胞消化液。

（4）待细胞收缩并逐渐脱离后，加入MSC完全培养基终止消化。

（5）收集细胞悬液，以300×g离心5min。

（6）弃上清，以MSC完全培养基重悬细胞。

4.3 细胞接种

（1）进行细胞计数并调整细胞浓度。

（2）按5×10³cells/cm²接种至明胶包被的6孔板。

（3）每孔加入2mL MSC完全培养基。

（4）置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

4.4 成骨诱导

（1）待细胞融合度达到约60%时，吸弃MSC完全培养基。

（2）加入2mL预温的成骨诱导培养基。

（3）未诱导对照组同步更换标准完全培养基。

（4）继续培养2～4周。

（5）每周更换培养基2次，每次缓慢加入新鲜培养基，避免直接冲击细胞层。

5 ALP检测

5.1 检测时间

       建议在成骨诱导第7天进行ALP染色或活性检测。

5.2 基本操作

（1）吸弃培养基，以PBS轻洗细胞2次。

（2）按照所用ALP检测试剂说明完成固定、染色或酶活检测。

（3）在相同成像条件下观察并记录诱导组与未诱导组的染色差异。

5.3 结果判读

       成骨诱导组ALP阳性区域或ALP活性高于未诱导对照组，提示细胞已启动成骨分化。

6 茜素红S染色

6.1 检测时间

       建议在成骨诱导第21天进行；矿化较慢的细胞可延长至28天。

6.2 固定

（1）吸弃培养基。

（2）以PBS轻洗细胞1～2次。

（3）加入4%多聚甲醛固定液，使其完全覆盖细胞层。

（4）室温固定30min。

（5）吸弃固定液，以PBS轻洗1～2次。

6.3 染色

（1）加入适量茜素红S工作液，使其完全覆盖细胞层。

（2）室温染色5～10min。

（3）吸弃染色液。

（4）以PBS或去离子水轻柔清洗，直至洗液基本无色。

（5）显微镜下观察并记录矿化结节。

6.4 结果判读

       钙盐沉积和矿化结节呈橙红色至红色。诱导组染色范围和强度明显高于未诱导对照组，可支持成骨分化成功。

7 关键控制点

7.1 细胞状态

（1）细胞不宜过度传代。

（2）诱导前应保证细胞生长状态良好。

（3）不同来源MSCs不宜直接以同一阈值比较分化能力。

7.2 接种密度

       接种密度过低可能延迟分化；密度过高可能造成细胞层过早过度融合和局部脱落。

7.3 培养基更换

       换液时应避免冲击细胞层，特别是在矿化结节形成后。

7.4 染色判读

       茜素红S可与钙盐结合，但单独依靠染色结果不足以评价完整成骨过程，宜结合ALP、成骨相关基因或蛋白检测综合判断。

8 常见问题与原因分析

8.1 ALP染色较弱

（1）细胞状态不佳。

（2）诱导时间不足。

（3）诱导成分失效。

（4）细胞接种密度不适宜。

8.2 矿化结节较少

（1）β-甘油磷酸盐或抗坏血酸浓度不足。

（2）诱导周期过短。

（3）细胞来源或代次导致成骨潜能较弱。

8.3 非诱导组出现明显红染

（1）培养体系中存在较高钙磷沉积。

（2）茜素红S洗涤不充分。

（3）细胞培养时间过长或发生非特异性沉积。

9 安全与废弃物处理

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）多聚甲醛固定操作应在通风良好的条件下进行。

（3）固定液、染色废液及细胞培养废物应分类收集并按实验室规范处理。

10 间充质干细胞成骨分化及ALP与茜素红S鉴定相关产品

更多相关文章，详见下方：

[1] 用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化实验

[2] 间充质干细胞（MSCs）鉴定