本试剂盒适用于从1~5ml细菌培养液中提取高达20μg的去内毒素质粒DNA,该方法采用超顺磁性的磁性粒子纯化技术及特殊去内毒素结合液分离内毒素技术,提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提,操作简单方便,纯化的质粒可直接用于一代测序、酶切、PCR和细胞转染等相关实验。其处理后的产物用于科研检测使用。
适配仪器：
手工提取
产品组分表：
| M1373511 | Component | 48 T | Storage | | M1373511A | RNase A | 2.5mg | 2-8 ℃ | | M1373511B | 重悬液S1 | 14ml | RT | | M1373511C | 裂解液S2 | 14ml | RT | | M1373511D | 沉淀液N5 | 7ml | RT | | M1373511E | 内毒素去除液ETR | 5ml | RT | | M1373511F | 去内毒素结合液ERB | 20ml | RT | | M1373511G | 磁珠MXVB | 1.1ml | 2-8 ℃ | | M1373511H | 洗涤液 BW1 | 40ml | RT | | M1373511I | 洗涤液DW2 | 80ml | RT | | M1373511J | 洗脱液DE | 6ml | RT |
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储存条件及有效期
室温(15~30℃)保存,有效期为12个月。RNase A干粉室温运输和保存,长期保存(>3个月)放置于-20~8℃。磁珠MXVB长期保存(>7天)放置于2~8℃。
注意事项
1. 使用前请仔细阅读本说明书。
2. 本试剂盒中的多种缓冲液含有刺激性的胍盐,务必戴上手套,并按照安全标准预防措施来处理。不要让缓冲液接触到皮肤、眼睛以及黏膜,如果确实发生,请立即用大量清水清洗并就医。
3. 如因气温较低,溶液出现沉淀,需要30℃水浴至沉淀完全溶解后方可使用。
4. 如因气温较低,裂解液S2出现沉淀,可37℃水浴至沉淀完全溶解后使用。
5. 如因气温较低,用力振荡后磁珠无法重悬,请勿使用。
6. 本试剂盒中的多种缓冲液含胍盐,请勿用氧化性消毒剂如次氯酸钠进行处理,否则会释放有毒气体,须按医疗废物进
行处理。
备注
1)本试剂盒需配套使用,不同批号试剂盒中各组分不可以互换或混用。
2)自备试验器材:
恒温水浴锅(当溶液出现沉淀时使用)、磁力架(1.5/2.0ml)、1.5ml无菌无核酸酶离心管、各种规格移液器及Tips(20、200、1000 μl)
样本要求
1. 适用标本类型:1~5ml细菌培养液。
2. 标本保存和运输:标本可立即用于测试,也可以保存于-70℃或更低温度待测,保存期为6个月,应避免反复冻融。标本运输采用冷链运输。
3. 冻融要求:速冻速融,避免反复冻融。
使用方法
1. 试剂准备
1.1 实验前检查溶液是否有沉淀,磁珠是否能重悬。
1.2加入1~1.5ml重悬液S1至RNase A干粉中,颠倒混匀/轻柔涡旋使RNase A充分溶解,然后把RNase A全部转移至重悬液S1中,混匀后于2~8℃保存,有效期为6个月。
2. 操作步骤
磁分离操作建议(步骤2.9开始):离心管置于磁力架后,轻轻地左右旋转,待磁珠聚集于贴近磁力架的管壁后,轻轻地颠倒磁力架数次,使管盖上的磁珠也聚集到管壁,静置数分钟至溶液澄清即可(静置时长视磁力架磁性而定)
2.1 在10~20ml培养管中加入1~5ml含抗生素的LB培养液,将含目的载体的菌种接种至培养瓶中,37℃摇床培养12~16小时。
注意:建议使用LB培养基,如使用TB、YT等丰富培养基来培养细菌,样本量需减半。
2.2 10,000×g离心1分钟,收集1~5ml菌体。倒弃培养基,在吸水纸上轻轻拍打吸尽残液。
2.3 加入250μl S1/RNase A混合液,高速涡旋重悬细菌。
注意: 请务必彻底悬浮细菌沉淀,如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解效果,导致提取量和纯度偏低。
2.4 往重悬液中加入250μl裂解液S2,轻柔颠倒混匀8~10次。室温放置1~2分钟。
注意:需轻轻颠倒混匀,涡旋会引起基因组DNA污染,溶液变得粘稠而透亮表明细菌已充分裂解。若出现裂解液S2裂解不完全的情况,建议适当减少菌量。
2.5 随即加入125μl沉淀液N5,立即颠倒混匀8~10次让溶液彻底中和。
注意:加入沉淀液N5后应立即颠倒混匀,以防止沉淀团聚而影响中和效果,菌液用量较多时,中和也会较难进行,中和时需要稍用力颠倒数次至溶液彻底中和,中和后沉淀应为白色,如未彻底中和可增加混匀次数至完全中和。
2.6 10,000×g离心5分钟。
2.7 可按需选择以下操作步骤:
(快速提取,适用于普通转染级质粒提取,提取质粒内毒素含量约200~500EU/μg)
无需处理,按照步骤2.8进行后续操作。
(增强型去内毒素质粒提取,适用于需求更低内毒素含量的质粒提取,提取质粒内毒素含量约0.1~2.5EU/μg)
转移上清至新的离心管中,加入1/10体积的内毒素去除液ETR,如600μl上清加入60μl内毒素去除液ETR。颠倒混匀后置4℃冰箱冷藏10分钟,取出后42℃温浴5分钟。10,000×g离心3分钟。
2.8 转移500μl上清液至新的离心管中,加入350μl去内毒素结合液ERB,20μl磁珠MXVB,涡旋混匀5~7分钟使磁珠吸附DNA。
2.9 转移至磁力架上磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.10 加入700μl洗涤液BW1,浸泡30秒再涡旋打散磁珠,转至磁力架上进行磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.11 加入700μ1洗涤液DW2,涡旋30秒打散磁珠后转至磁力架上进行磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.12 再次加入700μl洗涤液DW2,涡旋30秒打散磁珠后转至磁力架上进行磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.13 加入50~80μl洗脱液DE,高速涡旋2~3分钟打散磁珠。
2.14 60℃温浴3~5分钟,然后高速涡旋30秒。
2.15 瞬时离心收集管盖液滴至管中,转移至磁力架上吸附至溶液澄清。
2.16 把质粒DNA溶液转移至新的离心管中待用。如果不立即使用,请存储于-15~25℃,长期保存请放置于-70℃或更低的温度。
方法的局限性
1. 对于某些取样不佳的样本,提取产物中可能存在少量杂质抑制PCR扩增。
2. 样本核酸的提取效果与样本收集、处理、运输和保存质量密切相关,其中任何失误都将会导致结果不准确。
ZJ25F0825459
危险品化学品经营许可证（带存储）