密度梯度离心通过建立不同密度的介质环境，使细胞、细胞器、膜性颗粒、大分子复合物及核酸依据沉降行为或浮力密度实现分级。胶体二氧化硅介质、聚蔗糖介质、碘克沙醇、蔗糖和CsCl具有不同的理化性质及适用范围。

        关键词：密度梯度离心；胶体二氧化硅；聚蔗糖；碘克沙醇；蔗糖；CsCl

1 密度梯度分离的物理基础

1.1 颗粒沉降与浮力密度

（1）颗粒与介质的密度差

        颗粒在离心场中的迁移由离心作用、浮力和黏滞阻力共同决定。当颗粒密度高于周围介质时，其净迁移方向指向离心管底部；随着颗粒进入密度逐渐升高的梯度区域，颗粒与介质之间的密度差减小，沉降速度相应下降。当介质密度接近颗粒浮力密度时，进一步迁移的净驱动力趋近于零。

（2）粒径、形状与介质黏度

        浮力密度并非决定颗粒迁移行为的唯一因素。对于密度相近的颗粒，粒径和形状差异仍可导致不同的沉降速度；介质黏度升高则增加颗粒运动阻力。因此，速率区带分离主要利用颗粒沉降系数差异，而等密度分离更依赖颗粒本身的浮力密度。

（3）梯度对分离区带的稳定作用

        沿离心管轴向逐渐升高的介质密度能够抑制液体对流和组分混合，使不同颗粒维持相对集中的分离区带。密度梯度因此同时承担调节颗粒迁移和稳定分离界面的作用。

1.2 速率区带、等密度与密度屏障分离

（1）速率区带离心

        速率区带离心（rate-zonal centrifugation）主要依据颗粒沉降速度进行分离。样品通常加载于梯度顶部，沉降系数较大的颗粒在相同离心条件下迁移距离更长。由于梯度最高密度通常仍低于目标颗粒的浮力密度，分离位置具有明显的时间依赖性；离心时间过长可使不同组分继续向管底迁移。核糖体亚基、单核糖体和多聚核糖体的蔗糖梯度分析属于典型应用。

（2）等密度离心

        等密度离心（isopycnic centrifugation）主要依据颗粒浮力密度进行分离。颗粒沿梯度迁移至介质密度与自身浮力密度接近的区域后，净沉降驱动力趋于平衡并形成稳定区带。细胞器、膜性颗粒、病毒和核酸均可在适宜介质中利用这一原理进行分级。

（3）密度屏障分离

        密度屏障分离是在样品下方设置特定密度的介质层。能够进入并穿过该介质层的组分继续向下迁移，而不能有效穿过的组分则富集于界面。预制聚蔗糖密度分离介质用于外周血单个核细胞（PBMC）分离是该模式的典型应用。

1.3 阶梯梯度、连续梯度与自生成梯度

        阶梯梯度由若干不同密度的介质层依次构成，目标颗粒通常富集于相邻密度层之间的界面，适用于密度范围相对明确的组分分级。连续梯度的介质密度沿离心管轴向平滑变化，可提高密度接近组分之间的分辨能力。部分介质还可在离心场中重新分布形成自生成梯度，胶体二氧化硅介质、碘克沙醇和CsCl均可在相应条件下建立连续密度变化。

2 胶体二氧化硅介质

2.1 胶体二氧化硅的密度特性

（1）胶体颗粒提供介质密度

        胶体二氧化硅密度梯度介质以胶体二氧化硅颗粒作为主要密度来源，可采用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包覆或硅烷修饰的胶体二氧化硅颗粒。其介质密度主要来源于分散于液相中的高密度胶体颗粒，与依赖大量低分子溶质提高密度的体系具有不同的物理基础。

（2）低黏度与温和渗透条件

        胶体颗粒提供密度的方式使胶体二氧化硅介质在较高介质密度下仍具有相对较低的黏度，并减少高浓度小分子介质造成的渗透压负担。经适当缓冲和离子组成调整后，可形成适用于完整细胞和亚细胞结构的分离环境。

2.2 预制梯度与自生成梯度

（1）预制梯度

        不同密度的胶体二氧化硅工作液可预先构建为阶梯或连续梯度。目标细胞或细胞器在离心过程中进入相应密度区域，并依据沉降行为和浮力密度形成分带。

（2）自生成梯度

        胶体二氧化硅颗粒可在较高离心力下发生沉降和重新分布。在适宜的转子、离心力和离心时间条件下，相对均一的胶体二氧化硅悬液可逐渐形成连续密度梯度。

2.3 白细胞与亚细胞颗粒分离

（1）白细胞亚群

        胶体二氧化硅介质可通过设置多个密度层进一步区分中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞及其他具有密度差异的白细胞亚群。与固定密度聚蔗糖屏障相比，其密度范围设置更加灵活，适用于白细胞亚群的进一步分级。

（2）细胞器

        线粒体、溶酶体、过氧化物酶体和分泌颗粒等可首先通过差速离心获得粗组分，再利用胶体二氧化硅介质进一步去除密度不同的膜碎片和其他细胞器。

（3）组织碎片与低密度组分

        胶体二氧化硅介质还可用于部分组织单细胞制备中的髓鞘、死亡细胞和低密度碎片去除，降低非细胞组分对流式细胞术及单细胞分析的干扰。

2.4 胶体二氧化硅介质的适用边界

        胶体二氧化硅介质属于胶体颗粒体系，目标组分回收后通常需要通过稀释、洗涤或再次离心降低残余介质含量。残留胶体可能影响部分光学测定和蛋白定量，因此蛋白组学、酶活分析等研究通常需要充分去除残余胶体介质。对于尺寸较小且需要较高浮力密度分辨率的膜性颗粒，碘克沙醇通常更具优势。

3 聚蔗糖介质

3.1 高度支化聚蔗糖结构

        聚蔗糖介质可由蔗糖与环氧氯丙烷交联形成高度支化的亲水性polysucrose聚合物。其结构紧凑、亲水性较强且基本不带离子基团，可作为生物样品密度分离体系中的高分子介质。不同平均分子量的聚蔗糖材料可用于细胞分离及聚蔗糖介质性质研究。

3.2 聚蔗糖原料与预制聚蔗糖分离介质的区别

（1）聚蔗糖是高分子介质组分

        不同平均分子量和规格的聚蔗糖材料可作为密度介质组成成分参与分离体系构建，其应用差异主要与分子量、浓度和体系设计有关。

（2）预制聚蔗糖密度分离介质

        预制聚蔗糖密度分离介质并非仅由聚蔗糖聚合物组成，而是由聚蔗糖及高密度组分等构成的预制细胞分离体系。其密度和渗透性质可针对特定血细胞分离需求进行调节，因此与聚蔗糖高分子原料具有不同的应用定位。

3.3 血细胞的密度屏障分离

（1）红细胞和多数粒细胞向下迁移

        全血覆盖于聚蔗糖密度分离液上方并离心后，红细胞和多数粒细胞具有较高有效密度，可进入分离介质并继续向下迁移，主要分布于介质下方或形成沉淀。

（2）PBMC富集于界面

        淋巴细胞和单核细胞不能像红细胞和多数粒细胞一样有效穿过密度屏障，因此主要富集于血浆与分离介质之间的界面。该过程属于固定密度屏障介导的细胞分层，并非各种细胞分别达到精确的等密度位置。

3.4 不同密度的预制聚蔗糖分离体系

        不同预制聚蔗糖密度分离介质可通过设定不同密度改变细胞分离窗口。经典约1.077 g/mL体系主要用于外周血单个核细胞分离，而1.084 g/mL等较高密度介质可用于密度范围不同的单个核细胞或其他血细胞体系。

3.5 低密度粒细胞共分离

        感染、慢性炎症和肿瘤等病理状态下可出现低密度中性粒细胞，其有效密度降低后能够与PBMC共同富集于界面。因此，疾病样本中的聚蔗糖分离液界面不能等同于完全不含粒细胞的PBMC群体，细胞组成仍需结合表面标志或其他分离方法进一步确认。

4 非离子含碘介质：碘克沙醇

4.1 高密度与近等渗特性

（1）高分子量与高碘含量

        碘克沙醇（iodixanol）属于非离子型二聚含碘化合物，其较高分子量和高碘含量使其能够在较低摩尔浓度下获得较高介质密度。

（2）高密度与近等渗条件

        碘克沙醇可在较高介质密度下建立接近等渗的环境，使高密度条件与相对温和的渗透环境兼容。这一性质构成其用于完整膜性颗粒和细胞器分离的重要基础。

4.2 膜性颗粒的结构保持

        细胞器、细胞外囊泡（EV）和包膜病毒均具有脂质膜结构，其颗粒体积和浮力密度容易受到外界渗透压影响。高渗介质可导致颗粒失水收缩并改变其实际浮力密度。碘克沙醇能够在较高介质密度下维持相对温和的渗透环境，从而减少介质本身造成的颗粒物理状态改变。

4.3 细胞器、EV与病毒分离

（1）细胞器

        线粒体、过氧化物酶体、溶酶体、细胞核、内质网、高尔基体和质膜等均可利用碘克沙醇进行密度分级。近等渗条件可降低细胞器失水或膨胀造成的人为浮力密度偏移。

（2）细胞外囊泡

        EV与脂蛋白、蛋白聚集体及其他非囊泡颗粒在粒径上存在重叠，仅依赖差速离心难以充分区分。碘克沙醇梯度引入浮力密度这一额外分离维度，可减少部分共同沉降组分的污染。

（3）病毒颗粒

        不同成熟或装配状态的病毒颗粒可具有不同浮力密度，并在碘克沙醇梯度中形成相应分带。对于包膜病毒，近等渗条件还可减少高渗环境对病毒包膜和颗粒体积的影响。

4.4 碘克沙醇的适用边界

        碘克沙醇分离仍以颗粒之间存在有效浮力密度差异为基础。对于浮力密度高度重叠的颗粒，需要结合尺寸排阻、亲和捕获等正交分离方法进一步纯化；回收样品中的残余碘克沙醇也应根据后续分析要求进行去除或缓冲液置换。

5 蔗糖：经典速率区带与亚细胞分级介质

5.1 浓度、密度、黏度与渗透压

（1）浓度与介质密度

        蔗糖具有较高水溶性，通过改变浓度可连续调节介质密度，并构建阶梯或连续梯度。其浓度控制方便、体系成熟，是经典的生物密度梯度介质。

（2）浓度与介质黏度

        蔗糖浓度升高会同步增加溶液黏度，从而降低颗粒在离心场中的迁移速度。因此，蔗糖速率区带分离中的颗粒位置同时受到梯度组成、离心力和离心时间影响。

（3）浓度与渗透压

        高浓度蔗糖同时形成较高渗透压。对于具有完整膜结构的颗粒，水分跨膜迁移可导致体积收缩，并进一步改变其浮力密度和分带行为。

5.2 核糖体与RNP复合物

（1）核糖体与多聚核糖体

        线性蔗糖梯度广泛用于核糖体沉降分析。核糖体小亚基、大亚基、单核糖体和不同长度的多聚核糖体具有不同沉降系数，可在固定离心条件下分布于梯度不同区域，用于评价核糖体装配状态及翻译复合物组成。

（2）RNP与蛋白复合物

        核糖核蛋白复合物（RNP）及其他大型蛋白复合物可依据沉降系数差异进行蔗糖梯度分级。此类实验主要属于速率区带离心，反映不同复合物在限定离心条件下的相对沉降行为。

5.3 细胞器与病毒分级

（1）亚细胞颗粒纯化

        差速离心得到的粗线粒体、内质网或其他膜性组分可进一步通过蔗糖梯度按照密度和沉降特性进行分级，从而降低其他亚细胞组分污染。

（2）病毒颗粒分级

        蔗糖垫层、阶梯梯度和连续梯度均可用于部分病毒颗粒的浓缩和分级。对于具有包膜且对渗透条件较敏感的病毒，需要同时考虑高浓度蔗糖对颗粒体积和膜结构的影响。

5.4 不同级别蔗糖的研究适配

（1）分子生物学与无核酸酶级

        核糖体、多聚核糖体和RNA相关RNP研究涉及RNA完整性控制，适合采用分子生物学级或RNase、DNase Free蔗糖，以降低外源核酸酶对样品的影响。

（2）细胞培养级

        完整细胞和细胞器相关体系更关注介质的生物相容性。用于细胞培养、昆虫细胞培养或植物细胞培养的蔗糖可分别对应不同来源的生物样品。

（3）高纯度、药典与低内毒素级

        ACS、AR、PharmPure™及GMP相关级别可根据原料纯度、内毒素和质量控制要求进行选择。上述级别差异主要影响介质质量背景和下游适配性，并不改变蔗糖梯度的基本分离机制。

6 CsCl：高密度等密度梯度与核酸分离

6.1 CsCl自生成等密度梯度

        氯化铯（CsCl）具有较高溶解度，可形成高密度溶液。在超速离心场中，CsCl在沉降和扩散作用下建立稳定的连续密度梯度，样品中的大分子随后迁移至与自身浮力密度相对应的区域，因此CsCl体系属于典型的自生成等密度梯度。

6.2 DNA与RNA的浮力密度分离

（1）核酸组成与浮力密度

        DNA和RNA在CsCl梯度中的平衡位置受到核酸组成、构象及水合状态影响。不同核酸组分达到等密度位置后形成相对集中的区带，使分离结果主要反映浮力密度差异。

（2）DNA组成差异的密度分辨

        DNA碱基组成可影响其浮力密度，因此CsCl等密度梯度可用于不同DNA组分、基因组DNA及相关核酸颗粒的分级，形成与按分子大小分离不同的分离维度。

6.3 核酸纯化与相关颗粒分离

        CsCl梯度可用于DNA、RNA及部分核酸相关颗粒的高纯度分离。其较宽的高密度范围适合利用核酸本身的浮力密度差异进行精细分级。

6.4 CsCl体系的适用边界

        CsCl等密度梯度通常需要较高离心力和较长离心时间，分离后还需去除高浓度盐。对于常规快速核酸纯化，柱式、磁珠或沉淀方法更为便捷；CsCl主要适用于需要依据浮力密度进行精细分级的研究。

7 密度梯度介质的比较与选择

7.1 主要密度梯度介质的性能比较

7.2 不同研究对象的介质选择

7.3 血细胞分离：聚蔗糖介质与胶体二氧化硅介质

        聚蔗糖/预制聚蔗糖密度分离介质主要利用固定密度屏障实现PBMC与红细胞、粒细胞之间的快速分层，适合单个核细胞富集。需要进一步区分中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其他具有不同密度特征的白细胞亚群时，胶体二氧化硅多层或连续梯度具有更高的密度设置灵活性。

7.4 细胞器分离：胶体二氧化硅、碘克沙醇与蔗糖

        细胞器通常先通过差速离心获得粗组分，再根据纯度和结构保持需求选择梯度介质。胶体二氧化硅介质适合相对温和条件下的进一步纯化；碘克沙醇适用于渗透压敏感膜性细胞器及精细浮力密度分级；蔗糖则适用于经典亚细胞分级体系。

7.5 EV与病毒：碘克沙醇和蔗糖

        EV分离需要在颗粒尺寸之外引入浮力密度信息，并尽量维持膜结构和颗粒体积，因此碘克沙醇是常用的精细密度分离介质。病毒分离则可根据研究目的选择蔗糖垫层或梯度进行浓缩和分级，或采用碘克沙醇进一步提高浮力密度分辨率并降低高渗环境对包膜颗粒的影响。

7.6 核糖体与RNP：蔗糖

        核糖体、RNP及大型蛋白复合物主要依据沉降系数差异进行分级，线性蔗糖梯度仍是经典的速率区带体系。涉及RNA完整性控制时，可进一步选择分子生物学级或RNase、DNase Free蔗糖。

7.7 核酸：CsCl

        CsCl适用于利用浮力密度差异对DNA、RNA及相关核酸组分进行等密度分级。与常规柱式或磁珠纯化相比，其主要价值在于提供浮力密度这一独立分离维度，而不是常规快速核酸提取。

8 产品

参考文献

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更多相关文章，详见下方：

[1] 通过 CsCl 等密度梯度离心纯化λ噬菌体颗粒实验

[2] λ 噬菌体臂的纯化（通过蔗糖密度梯度离心）实验

[3] 密度梯度细胞分离法