1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于DRAQ5与DRAQ7两种远红区细胞核染料的标准化使用，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测平台下的活细胞核标记、死亡细胞识别、固定样本核复染以及免疫荧光配套检测。规程包含两类常用流程：

        （1）DRAQ5活细胞核快速染色流程；

        （2）DRAQ7死亡细胞或固定/通透样本核染色流程。

        可根据实验目的选择其一或组合使用；若实验同时涉及活细胞观察与膜完整性评价，也可在同一研究设计中设置DRAQ5与DRAQ7的分组对照或顺序检测模块。

1.2 原理简介

        （1）DRAQ5是一种可透过细胞膜和核膜的远红荧光DNA染料，兼具亲脂性与水溶性，可直接进入活细胞、固定细胞及部分组织样本，实现快速细胞核标记。该染料通常无需洗涤，适合活细胞实时观察、自动化检测及DNA含量分析等应用。

        （2）DRAQ7是一种对活细胞非渗透性的远红荧光DNA染料，主要进入死亡、凋亡晚期或膜完整性受损细胞，因此适用于活/死细胞区分、细胞毒性评价以及终点染色分析。对于固定并透化后的样本，DRAQ7也可作为远红核染料用于免疫荧光配套检测。

        （3）两种染料虽然均以DNA为靶点并位于远红区，但实验定位不同。DRAQ5用于总体核标记，DRAQ7更适合死亡或膜受损细胞识别。在实验设计与结果解释时，应将两者分开处理。

2 材料与试剂

2.1 染料与基本参数

（1）DRAQ5

        ①适用于活细胞、固定细胞及部分组织样本核染。

        ②分子式：C22H28N4O4。

        ③分子量：412.49。

        ④CAS号：254098-36-7。

        ⑤Ex/Em：601/699 nm。

（2）DRAQ7

        ①适用于死亡细胞、膜受损细胞识别，也可用于固定/通透样本核染。

        ②Ex/Em：633/695-697 nm。

        ③4℃避光保存。

2.2 缓冲液与培养体系

（1）PBS缓冲液

        ①要求不含叠氮化钠。

        ②用于细胞重悬、冲洗及工作液稀释。

（2）细胞培养基

        ①活细胞实验中可直接使用适合目标细胞的培养基配制DRAQ5工作液。

        ②不同细胞类型对培养条件变化敏感，实验前后宜保持培养体系一致。

2.3 固定与透化试剂

        （1）4%多聚甲醛PBS固定液。

        （2）0.5% Triton X-100/PBS透化液。

        （3）免疫荧光封闭液及二抗体系（可选）。

2.4 样本类型

        （1）悬浮细胞。

        （2）贴壁细胞。

        （3）细胞爬片。

        （4）组织切片。

        （5）固定并透化后的终点样本。

2.5 耗材与仪器

        （1）离心管、移液枪头、培养板或载玻片。

        （2）荧光显微镜或共聚焦显微镜。

        （3）流式细胞仪。

        （4）避光操作用品。

3 工作液与实验条件准备

3.1 DRAQ5工作液

        （1）建议使用PBS或相应培养基按1:1000比例稀释，现配现用。

        （2）对于活细胞实验，优先使用原培养体系或与其相容的培养基进行稀释，以减少细胞状态波动。

        （3）DRAQ5通常可在其他染色实验完成后再加入，也可直接加入细胞培养体系中用于活细胞检测。

3.2 DRAQ7工作液

        （1）DRAQ7应根据细胞类型、样本状态及仪器灵敏度进行预实验优化。

        （2）常用稀释范围建议为1:15至1:200。

        （3）在固定并透化样本中，DRAQ7通常作为其他荧光步骤完成后的终点核染步骤加入。

3.3 孵育与避光要求

        （1）DRAQ5与DRAQ7均应尽量在避光条件下操作，以降低荧光淬灭。

        （2）室温染色通常为5～30 min；若在37℃环境中进行，染色进程会明显加快，应相应缩短孵育时间。

        （3）不同细胞类型、样本厚度和固定状态均会影响染色动力学，应以预实验确定最佳条件。

3.4 多色实验设计要点

        （1）由于DRAQ5激发波长范围较宽，不建议与其他可被488 nm或633 nm激发的远红荧光染料联用。

        （2）DRAQ7在488～647 nm范围内存在吸收，不建议与其他依赖488 nm或633 nm激发的远红荧光探针联用。

        （3）进行多色分析时，宜将绿色、橙红色等探针安排在与远红通道分离较好的检测窗口中，以降低串色与补偿负担。

        （4）含DAPI、Hoechst 33342或PI的复合封片液不适合作为本规程中的默认配套封片方案，以免额外引入核染或死活染信号。

4 实验流程A：DRAQ5活细胞核染色

4.1 实验设计与适用场景

        （1）适用于活细胞核实时标记。

        （2）适用于无需洗涤的快速终点核染色。

        （3）适用于与GFP等绿色荧光蛋白联合进行核定位观察。

        （4）适用于DNA含量分析及自动化成像流程中的细胞核标记。

4.2 操作步骤

（1）缓冲液或培养基准备

        ①准备不含叠氮化钠的PBS，或根据细胞类型准备相应培养基。

        ②如为活细胞检测，建议优先采用与原培养环境一致的培养基体系。

（2）样本准备

        ①对于悬浮细胞，用PBS或培养基重悬细胞。

        ②细胞密度建议不超过4×10^5 cells/mL。

        ③对于贴壁细胞，可根据细胞融合度估算细胞密度。

        ④对于组织切片，可根据切片面积及厚度估计样本负载量。

（3）染液加入

        ①将DRAQ5按1:1000比例稀释。

        ②直接滴加至细胞悬液、贴壁细胞培养孔或组织切片表面。

        ③加样时应尽量均匀，避免局部浓度过高导致信号不一致。

（4）孵育

        ①轻轻混匀，使染液分布均匀。

        ②室温避光孵育5～30 min。

        ③若在37℃条件下孵育，建议将时间缩短至1～3 min。

        ④不同细胞类型染色速度不同，应通过预实验进一步优化。

（5）检测

        ①通常无需洗涤或进一步处理。

        ②可直接进行荧光显微镜观察、共聚焦成像或流式细胞仪检测。

4.3 结果判读要点

        （1）DRAQ5可对细胞核产生快速、相对均一的远红信号，适合作为核定位参照。

        （2）由于DRAQ5可进入活细胞，因此其阳性并不代表细胞死亡或膜损伤。

        （3）若用于DNA含量分析，应保持染色时间、细胞状态、检测参数和样本处理流程在组间一致。

5 实验流程B：DRAQ7死亡细胞或固定/通透样本核染色

5.1 实验设计与适用场景

        （1）适用于死亡细胞、膜完整性受损细胞的识别。

        （2）适用于细胞毒性实验中的终点检测。

        （3）适用于固定并透化样本的远红核复染。

        （4）适用于与免疫荧光联合的固定样本核染色。

5.2 标准操作步骤

（1）缓冲液准备

        ①准备不含叠氮化钠的PBS缓冲液。

（2）固定

        ①用4%多聚甲醛PBS于室温固定15 min。

（3）冲洗

        ①用PBS冲洗细胞2次，去除残余固定液。

（4）透化

        ①将细胞置于0.5% Triton X-100/PBS中，室温透化10 min。

（5）再次冲洗

        ①用PBS冲洗细胞2次。

（6）可选免疫荧光步骤

        ①根据实验设计进行标准免疫荧光染色。

        ②建议将DRAQ7安排在其他荧光染色完成后加入，以减少流程中信号损失。

（7）DRAQ7染色

        ①根据不同细胞类型和检测需求，将DRAQ7稀释至最佳浓度。

        ②建议先在1:15至1:200范围内进行预实验优化。

        ③室温避光染色5～30 min。

        ④若在37℃条件下染色，通常更快，可适当缩短时间。

（8）检测

        ①可使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或流式细胞仪进行远红通道检测。

        ②采集参数应在组间保持一致，以便进行后续比较。

5.3 活/死细胞判读原则

        （1）在未固定、未透化的体系中，DRAQ7主要进入死亡或膜完整性受损细胞，因此可用于活/死细胞区分。

        （2）在固定并透化后的样本中，DRAQ7将不再反映细胞原始膜完整性状态，而主要作为普遍核染料使用。

        （3）若研究目标为死亡率评价，不应将固定透化后DRAQ7阳性率直接解释为原始死亡比例。

6 可选扩展模块：DRAQ5与DRAQ7联合应用

6.1 联合应用思路

        （1）DRAQ5用于总体细胞核标记。

        （2）DRAQ7用于死亡或膜受损细胞识别。

        （3）在合适的仪器通道分辨条件下，可分别获取总核数与受损核数信息。

6.2 应用建议

（1）显微成像

        ①可用DRAQ5标定全部细胞核位置。

        ②用DRAQ7识别死亡或膜受损细胞核。

        ③可进一步统计总核数、DRAQ7阳性核数及阳性比例。

（2）流式分析

        ①先排除碎片和异常事件。

        ②在设定细胞群后，以DRAQ7阳性群体定义死亡或膜受损细胞。

        ③若需联合DRAQ5使用，应先确认仪器光路与补偿设置可实现有效区分。

（3）技术限制

        ①两者均位于远红区，联合使用前必须确认滤光片配置、激发光源与补偿方案是否适配。

        ②若检测平台远红通道区分能力有限，更适合将DRAQ5和DRAQ7分开用于不同实验，而不是强行同孔共染。

7 质控要点

7.1 染料处理

        （1）避免反复冻融，建议分装保存。

        （2）使用前建议短暂高速离心数秒，使液体沉降至管底。

        （3）存放及操作过程中应尽量避光，以减缓荧光淬灭。

7.2 样本状态控制

        （1）活细胞实验中，换液、吹打、离心及温度波动均可能影响膜完整性，进而改变DRAQ7背景信号。

        （2）悬浮细胞密度过高时，可能导致染料扩散受限、信号不均或流式聚团。

        （3）贴壁细胞融合度过高时，核间边界不清，可能影响成像分割与计数分析。

7.3 成像与检测一致性

        （1）同一实验内应固定曝光时间、激光功率、增益与阈值设置。

        （2）不同组别之间不能通过单独调节亮度代替真实信号比较。

        （3）用于定量分析时，应统一染色时间和上机顺序，减少时间漂移带来的系统误差。

8 常见问题与原因分析

8.1 DRAQ5染色偏弱

        （1）染料稀释过度或保存条件不当。

        （2）孵育时间过短，尤其在低温条件下进入细胞速度较慢。

        （3）细胞密度过高或组织样本过厚，导致染料分布不均。

        （4）远红通道检测参数设置偏低。

8.2 DRAQ5背景偏高或染色不均

        （1）加样后未充分混匀。

        （2）贴壁细胞培养孔内液层厚度不一致。

        （3）局部蒸发导致染料浓缩。

        （4）样本边缘区域成像条件与中心区域不一致。

8.3 DRAQ7阳性率异常升高

        （1）样本处理过程造成额外膜损伤，如吹打过强、离心过度或温度刺激。

        （2）细胞基础状态较差，原始死亡水平较高。

        （3）将固定透化后的样本按活/死细胞逻辑进行解释，导致判读错误。

8.4 多色实验串色明显

        （1）远红区染料使用过多。

        （2）与可被488 nm或633 nm激发的其他远红荧光探针同时使用。

        （3）滤光片配置、补偿设置或通道分离策略不合适。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

        （1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

        （2）涉及固定液、透化液及生物样本时，应按实验室安全规范操作。

9.2 废弃物处理

        （1）含细胞样本、固定液或染料残液的废弃物应分类收集并规范处置。

        （2）所有操作应符合本单位生物安全及化学品管理要求。

10 DRAQ5与DRAQ7实验相关产品表

更多相关文章，详见下方：

[1] 细胞死亡、增殖与代谢活力的染色原理与方法