引言

        天然产物的化学组成在植物采收后仍可能继续变化。切割和粉碎改变组织完整性，水分、温度和pH影响内源酶活性，干燥和加热还会改变酶促反应、组织结构及部分化合物的化学稳定性。进入高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）或液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）系统的样品，已经经历采收、处理和提取等多个阶段。

        黄芩（Scutellaria baicalensis）提供了实验例证。改变黄芩粉末提取前的含水状态、温度、pH、处理时间和溶剂条件，可明显改变黄芩苷（baicalin）、汉黄芩苷（wogonoside）及相应苷元的测定结果[1]。黄芩根中还存在能够水解这些黄酮葡萄糖醛酸苷的内源β-D-葡萄糖醛酸苷酶（β-D-glucuronidase，GUS）[6]。样品前处理由此成为决定分析时实际化学组成的重要环节。

1 原生苷、次生苷与采后化学组成变化

1.1 原生苷和次生苷的传统含义

        传统生药学中，“原生苷”和“次生苷”用于描述部分糖苷在储存、加工或提取过程中的转化关系。某些原生苷经部分水解并脱去部分糖基后，可形成传统分类中的次生苷。经典洋地黄研究曾使用primary glycosides和secondary glycosides描述储存过程中发生的这类转化[2]。

        这组术语记录的是特定糖苷之间的转化关系。天然植物同时能够通过自身代谢途径合成不同糖基化程度的化合物，某一糖苷在样品中的实际来源还涉及植物代谢途径及采后处理历史。

1.2 糖基数量与化合物来源

        苦杏仁苷（amygdalin）和野黑樱苷（prunasin）具有不同的糖基化程度。对扁桃（Prunus dulcis）的研究表明，野黑樱苷本身是植物氰苷代谢途径中的正常产物，并可进一步接受糖基化形成苦杏仁苷[3]。

        由此可知——糖基数量较少的天然产物可以直接来源于植物正常代谢。样品处理中某种化合物是否由另一糖苷转化形成，可由处理前后定量变化、时间过程、相关酶活性以及植物代谢途径等证据确定。

2 组织破坏与内源酶促转化

2.1 植物组织中的空间限制

        糖苷及相关酶在植物组织中具有特定的组织、细胞或亚细胞分布。这样的空间组织会影响底物扩散以及酶与底物发生接触的机会。

        芥子油苷-黑芥子酶体系具有明确的组织定位证据。Höglund等采用免疫细胞化学方法研究油菜（Brassica napus），发现黑芥子酶（myrosinase）主要集中于少量特化细胞，组织中呈明显的非均匀分布[4]。拟南芥（Arabidopsis thaliana）花茎中还鉴定出富集芥子油苷的S-cells，研究报道其中芥子油苷浓度可超过100 mmol/L[5]。

        植物和器官之间的空间组织形式存在差异，可表现为不同细胞类型中的选择性分布，也可涉及细胞内部的区室化。共同的结果是组织结构参与控制酶、底物及其他反应组分之间的接触条件。

        切割、粉碎和研磨会破坏细胞和组织结构，同时促进细胞内容物释放和分子扩散。鲜植物材料仍保持较高内源酶活性时，组织破坏程度会直接影响糖苷在分析前的稳定性。

2.2 黄芩切割与粉碎后的黄酮组成变化

        黄芩根含有黄芩苷、汉黄芩苷及相应苷元黄芩素（baicalein）和汉黄芩素（wogonin）。Ikegami等从黄芩根中纯化得到β-D-葡萄糖醛酸苷酶，该酶能够水解黄芩苷和汉黄芩素葡萄糖醛酸苷，为黄芩葡萄糖醛酸苷的内源酶促水解提供了直接证据[6]。

        Bai等比较了鲜黄芩根切片和进一步粉碎后的成分变化。在室温、保湿条件下，鲜粉碎样品中的黄芩苷由0 h时的95.67 mg/g降至22 h时的5.04 mg/g，汉黄芩苷由17.89 mg/g降至1.13 mg/g，降幅分别为94.7%和93.7%；鲜切样品中的相关糖苷也随时间下降，但变化幅度较小[7]。

        两组材料具有相同来源并处于相近温度和含水条件，组织破坏程度的差异伴随着明显不同的糖苷变化速度。粉碎增大组织暴露面积的同时，还改变细胞完整性、底物释放和内源酶与底物的接触。粉碎后的放置时间也会直接反映在最终的糖苷及苷元定量结果中。

3 水、pH和提取溶剂对糖苷组成的影响

3.1 水相前处理改变黄芩黄酮组成

        Yu等系统考察了黄芩粉末的处理时间、温度、pH、药材/溶剂比例和溶剂种类。在50 ℃、药材/水比例1:5（w/v）、pH 6.67条件下处理4 h后，四种黄酮发生显著变化[1]。原论文按μM/g报告的数据如下。

        两种葡萄糖醛酸苷大幅下降，同时相应苷元明显升高。黄芩内源GUS的酶学研究进一步支持了这一变化中的糖苷水解过程[1,6]。

        水使植物粉末充分润湿，并改变酶、底物和植物基质之间的扩散与接触状态。对于保持内源酶活性的材料，水相处理既涉及成分溶出，也可为样品中的持续酶促转化提供反应环境。

3.2 pH和温度改变完整样品体系中的净转化

        Ikegami等研究的纯化黄芩GUS在50 mmol/L柠檬酸盐缓冲体系中的最适pH约为4.7[6]。Yu等研究黄芩粉末整体预处理时，在pH 6.67附近观察到较高的糖苷向苷元净转化程度[1]。

        两个pH值对应不同实验对象。纯化酶实验反映单一GUS在规定缓冲条件下的催化性质；植物粉末体系同时包含组织基质、底物释放、传质和多种内源成分。植物样品整体转化程度是这些因素共同作用后的实验结果。

        温度也会同时改变多个过程。Yu等比较5、25、37、50和90 ℃条件，在该黄芩粉末体系中，50 ℃条件下出现较明显的糖苷下降和苷元增加[1]。升温可以改变酶促反应速率和分子扩散，也会影响蛋白质稳定性以及目标化合物自身的化学反应。不同植物材料由此具有各自的温度响应范围。

3.3 提取溶剂改变酶促转化环境

        Yu等还比较了水和75%乙醇处理。样品在25 ℃以75%乙醇进行初始浸泡后再于50 ℃处理，黄芩苷、汉黄芩苷与相应苷元之间的转化明显受到限制[1]。

        75%乙醇对应这一研究中的具体实验条件。其他植物材料中，酶种类、蛋白质稳定性、初始含水量和样品组成均可能改变有机溶剂对酶活性的影响程度。

        提取溶剂一方面控制天然产物从植物基质向液相的分配和传质，另一方面改变内源酶所处的介质条件。溶剂组成由此可以同时影响提取量和提取过程中发生的化学转化。

4 干燥过程中的酶促转化与热变化

4.1 失水改变酶促反应持续时间

        植物采收后的干燥持续降低组织含水量。较高含水状态有利于酶和底物的扩散；水分降低后，许多依赖水相环境的酶促过程逐渐减弱。黄芩鲜粉碎样品在保湿条件下能够持续发生糖苷组成变化，显示含水状态与内源酶作用时间密切相关[7]。

        干燥过程中还同时发生温度变化和组织结构变化。较快失水能够缩短部分酶促转化的持续时间，升温则同时作用于酶活性、传质速度和目标化合物的化学稳定性。

4.2 黄芩糖苷与苷元对干燥方式的响应

        Zhang等比较了黄芩鲜根的日晒、阴干和60 ℃烘干。不同条件下，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素表现出不同的含量变化。日晒和阴干条件较有利于黄芩苷和汉黄芩苷的保持；60 ℃烘干过程中两种糖苷明显降低。黄芩素和汉黄芩素则表现出不同的变化特征，60 ℃烘干对两种苷元的相对保存优于日晒和阴干[8]。

        阴干温度较低，同时需要较长时间完成失水；日晒和烘干具有不同的温度、失水速度和处理时间。内源酶作用、热相关反应和水分变化在这些条件下具有不同的时间过程。相同干燥方法对糖苷和苷元产生的净影响可以不同。

4.3 肉苁蓉中酶促降解与热处理效应

        肉苁蓉（Cistanche deserticola）苯乙醇苷的研究显示，干燥前热处理可以明显改变后续降解过程。Huang等比较未经预处理以及经蒸汽、热水和微波处理的材料。未经处理样品中，松果菊苷（echinacoside）和类叶升麻苷（acteoside）的降解速率分别约为0.30～0.75和0.54～2.45 mg·mL⁻¹·h⁻¹，高于相应热模拟体系和微波预处理体系[10]。

        另一项研究比较了肉苁蓉鲜切片经直接烘干、96 ℃热水处理和不同时间蒸制后的成分变化。蒸制5分钟和7分钟后，毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和2′-乙酰毛蕊花糖苷含量均显著高于直接烘干组（P＜0.05）[9]。

        两项研究共同表明，热处理可以降低部分酶促降解，同时还会改变组织结构、目标成分稳定性以及后续提取释放。处理后的测定含量是这些过程共同作用的结果。

干燥过程中涉及的主要变化归纳如下：

干燥后的实际化学组成由上述过程共同形成。不同目标糖苷及其转化产物可以对同一种干燥条件表现出不同响应。

5 样品前处理与分析结果

5.1 分析对象由采样和处理状态共同定义

        天然产物分析可以对应不同样品状态。研究鲜植物采样时的组成，关注采后变化发生之前或变化程度较低的状态；炮制、干燥、发酵和生物转化研究则以处理后的化学组成为分析对象。

        同一种内源酶反应在不同实验目标中具有不同意义。采样时糖苷含量研究关注处理阶段发生的糖苷损失；苷元制备或加工转化研究则可以把相同反应纳入目标过程。

        样品状态由采样时间、组织状态、温度、水分、处理时间、干燥方式和提取条件共同定义。“原生苷”和“次生苷”描述特定糖苷之间的转化关系，采样与处理参数则记录实际接受分析的材料状态。

5.2 前处理稳定性的实验表征

样品前处理对目标成分稳定性的影响可以通过平行处理和时间过程实验表征。含有活性内源酶的植物材料中，以下变量具有实验意义：

        黄芩研究已经观察到粉碎、水相处理、pH、温度、溶剂组成和干燥方式对黄酮葡萄糖醛酸苷及苷元含量的影响[1,7,8]。肉苁蓉研究也记录了干燥前预处理、酶活变化和苯乙醇苷降解之间的关系[9,10]。

        以采样时组成为研究对象时，平行比较不同前处理方法可以确定目标糖苷在处理阶段的损失程度以及相关转化产物的形成情况。冻干、低温保存、有机溶剂处理和快速热处理在不同体系中的作用，需要由相应目标化合物的稳定性数据确定。

5.3 前处理变化直接进入最终分析结果

        HPLC、LC-MS等技术测定的是完成采样、前处理和提取后进入分析系统的化学组成。前处理阶段已经发生的糖苷水解、氧化、热转化及其他反应会直接反映在色谱峰面积、定量结果和成分比例中。

        仪器的分离度、灵敏度和定量精密度反映检测阶段的分析性能；样品处理阶段的稳定性决定进入检测系统的实际分析对象。黄芩在粉碎方式和水相处理条件改变后产生的大幅糖苷-苷元比例变化，表明样品处理因素与仪器检测性能分别影响分析流程的不同阶段[1,7]。

        样品处理中出现新的色谱峰或已知成分含量增加，首先表明处理前后的化学组成发生变化。未知产物的分子式、糖种类、连接位置、糖链顺序和立体构型则由质谱、核磁共振及其他结构证据进一步确定。

6 天然糖苷样品处理、内源酶转化与加工组成变化研究代表化学品分类表

表1 黄芩黄酮葡萄糖醛酸苷及对应苷元

表2 葡萄糖醛酸苷酶、酶学底物及葡萄糖醛酸化研究试剂

表3 苯乙醇苷及加工转化相关结构物

表4 氰苷、组成糖及酶蛋白处理试剂

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参考文献

[1] Yu C, Qu F, Mao Y, et al. Different extraction pretreatments significantly change the flavonoid contents of Scutellaria baicalensis. Pharmaceutical Biology, 2013, 51(10): 1228–1235. DOI: 10.3109/13880209.2013.784922.

[2] Fish F, Todd JP. Observations on the ageing of Digitalis tinctures. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1954, 6(1): 894–905. DOI: 10.1111/j.2042-7158.1954.tb11026.x.

[3] Thodberg S, Del Cueto J, Mazzeo R, et al. Elucidation of the amygdalin pathway reveals the metabolic basis of bitter and sweet almonds (Prunus dulcis). Plant Physiology, 2018, 178(3): 1096–1111. DOI: 10.1104/pp.18.00922.

[4] Höglund AS, Lenman M, Falk A, Rask L. Distribution of myrosinase in rapeseed tissues. Plant Physiology, 1991, 95(1): 213–221. DOI: 10.1104/pp.95.1.213.

[5] Koroleva OA, Davies A, Deeken R, Thorpe MR, Tomos AD, Hedrich R. Identification of a new glucosinolate-rich cell type in Arabidopsis flower stalk. Plant Physiology, 2000, 124(2): 599–608. DOI: 10.1104/pp.124.2.599.

[6] Ikegami F, Matsunae K, Hisamitsu M, Kurihara T, Yamamoto T, Murakoshi I. Purification and properties of a plant β-D-glucuronidase from Scutellaria root. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1995, 18(11): 1531–1534. DOI: 10.1248/bpb.18.1531.

[7] Bai C, Yang J, Cao B, et al. Growth years and post-harvest processing methods have critical roles on the contents of medicinal active ingredients of Scutellaria baicalensis. Industrial Crops and Products, 2020, 158: 112985. DOI: 10.1016/j.indcrop.2020.112985.

[8] Zhang L, Zhang X, Liang Z. Post-harvest processing methods have critical roles in the contents of active ingredients of Scutellaria baicalensis Georgi. Molecules, 2022, 27(23): 8302. DOI: 10.3390/molecules27238302.

[9] Peng F, Chen J, Wang X, et al. Changes in levels of phenylethanoid glycosides, antioxidant activity, and other quality traits in Cistanche deserticola slices by steam processing. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2016, 64(7): 1024–1030. DOI: 10.1248/cpb.c16-00033.

[10] Huang J, Peng Y, Ji Z, et al. Drying characteristics of Cistanche deserticola with different pretreatment and degradation mechanism of phenylethanoid glycosides during drying. Industrial Crops and Products, 2023, 204: 117339. DOI: 10.1016/j.indcrop.2023.117339.

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