链霉亲和素是一种源自细菌的蛋白质，能够以极高的亲和力特异性结合小分子生物素。这一链霉亲和素–生物素相互作用被认为是目前已知最强的非共价结合之一。链霉亲和素琼脂糖微珠正是基于这种高亲和力相互作用，被广泛用作固相载体，用于纯化生物素化的生物大分子（如蛋白质和DNA），并用于分析和评估分子间相互作用（见图1）。

         利用生物素与链霉亲和素之间的强力结合，可以通过链霉亲和素微珠对生物素化分子进行富集与纯化。当样品与微珠混合时，生物素化靶分子会特异性地结合在微珠表面，而未结合的杂质分子则在洗涤过程中被去除，从而获得所需的目标蛋白或DNA。

图1 负载生物素化蛋白的链霉亲和素琼脂糖微珠

什么是生物素化分子？

         “生物素化分子”是指在蛋白质或核酸上通过共价键连接了小分子生物素的分子。

         在自然界中，确实存在少量天然处于生物素化状态的蛋白质（Niers 等, 2011）。不过，在科研语境下提到“生物素化分子”时，我们通常是指研究人员为了后续表征和功能研究而有目的地将生物素引入到蛋白质或核酸中的这些分子。

         例如，研究者可以利用酶BirA对Avi标签中的某一个特定赖氨酸残基进行位点特异性生物素化（图2 左）（Fairhead & Howarth, 2015）。Avi标签是一种亲和标签，可与目标蛋白融合，从而实现对该蛋白的纯化或固定。与多数其他亲和标签不同，Avi标签在此类应用中必须先被生物素化，才能发挥作用。

         除了利用酶仅修饰单一赖氨酸这一方式外，还可以通过化学反应，在蛋白质分子内多个赖氨酸残基上实现“多位点”生物素化（图2 右）（Kay 等, 2009）。这种策略的优势在于：目标蛋白本身无需携带Avi标签，同时可在蛋白质的不同区域引入生物素标记。如果后续实验计划将该蛋白酶解或切割成较小片段，这种多位点标记会格外有用——相关内容将在下一节中进一步介绍。

图2 蛋白质可通过酶促方式在Avi标签中的特定赖氨酸残基上实现位点特异性生物素化（左），也可通过化学方法在蛋白质分子内多个赖氨酸残基上进行多位点生物素化（右）。

生物素化分子的纯化方法

​亲和纯化通常包括三个关键步骤：

1）使目标蛋白与微珠结合；

2）洗涤以去除污染蛋白；

3）洗脱目标蛋白。

         对于生物素化蛋白与链霉亲和素微珠而言，整体流程与上述亲和纯化过程相同。但由于链霉亲和素–生物素体系具有一些独特性质，这些步骤在具体操作上会略有不同。

         前文提到，链霉亲和素与生物素之间的结合是目前已知最强的天然非共价相互作用之一。也正因为这种超高亲和力，可以对微珠进行非常严格的洗涤，从而获得比 His 标签–镍微珠体系等更高纯度的目标蛋白。

         然而，这种强结合也带来了一个明显的缺点：将生物素化分子从链霉亲和素微珠上洗脱并不容易。通常需要使用较为“苛刻”的洗脱条件，例如极端pH的缓冲液、有机溶剂、对微珠加热，甚至通过切割将目标分子从微珠上释放下来。

         如果你希望进一步了解如何为自己的生物素化分子选择合适的洗脱策略，这篇文章将是一个不错的参考。如何从链霉亲和素微珠上洗脱生物素化蛋白质和核酸?

生物素化分子还有哪些用途？

         生物素化分子的另一大重要用途，是用于寻找其相互作用分子，也就是鉴定与其发生结合的其他分子类型。

         举例来说，假设你正在研究一种致癌蛋白。在生物体系中，分子几乎从不“单打独斗”，而是依赖一系列分子伙伴共同完成其功能。因此，如果想更深入地理解该蛋白如何促进肿瘤发生，一个关键起点就是找出那些参与或增强其致癌作用的相互作用分子。

         在实验上，可以采用这样一种策略：先对这条致癌蛋白进行生物素化处理，并将其固定在链霉亲和素微珠上，然后利用这些微珠从癌细胞中“捕获”能够与该蛋白结合的其他蛋白（见图3）。在鉴定出一个或多个与该致癌蛋白发生相互作用的蛋白之后，还可以进一步设计功能实验，以判定哪些相互作用真正参与并驱动肿瘤发生过程。

图3 将生物素化目标蛋白与链霉亲和素微珠结合后，可将该复合物作为“诱饵”，用于鉴定与之发生相互作用的蛋白质。

         这一点尤其令人振奋：一旦识别出某个驱动癌症发生发展的关键蛋白–蛋白相互作用，就可以围绕这一相互作用开展药物设计，通过阻断该相互作用来抑制肿瘤进程。事实上，正是基于这种思路，已经成功开发出多种目前在临床用于治疗癌症的药物（Nada 等, 2024）。

         尽管上面的示例以蛋白质为主，同样的整体策略也可以应用于DNA分子。举例来说，假设某个位点存在一个与癌症相关的单核苷酸变异，但目前尚不清楚该序列改变是如何促成肿瘤发生的。在这种情况下，可以对这段DNA进行生物素化，并利用链霉亲和素微珠富集与其结合的蛋白质。

         一种更巧妙的做法，是将原始（野生型）DNA序列与携带癌症相关突变的DNA序列进行对比，分别鉴定各自结合的蛋白质群体。通过这种比较，有助于筛选出可能特异性参与致癌功能的蛋白（见图4）。与前文蛋白质的例子类似，这类实验设计已被科学家用于解析某些癌症类型中具体出了什么问题（Carrasco Pro 等, 2023）。

图4 利用链霉亲和素微珠可以从样品中富集与生物素化DNA相互作用的蛋白质。在这一示意图中，蓝色蛋白同时结合野生型和突变型DNA，而深绿色蛋白只与突变型DNA结合。在这种假设情境下，深绿色蛋白将成为后续重点解析的对象。

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参考文献

[1] Niers JM, Chen JW, Weissleder R, Tannous BA. Enhanced in vivo imaging of metabolically biotinylated cell surface reporters[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(3): 994–999. doi:10.1021/ac102758m.

[2] Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA[J]. Methods in Molecular Biology, 2015, 1266: 171–184. doi:10.1007/978-1-4939-2272-7_12.

[3] Kay BK, Thai S, Volgina VV. High-throughput biotinylation of proteins[M]// Doyle SA, ed. High Throughput Protein Expression and Purification. Methods in Molecular Biology, Vol. 498. Totowa, NJ: Humana Press, 2009: 185–198. doi:10.1007/978-1-59745-196-3_13.

[4] Nada H, Choi Y, Kim S, Jeong KS, Meanwell NA, Lee K. New insights into protein–protein interaction modulators in drug discovery and therapeutic advance[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2024, 9: 341. doi:10.1038/s41392-024-02036-3.

[5] Carrasco Pro S, Hook H, Bray D, Berenzy D, Moyer D, Yin M, et al. Widespread perturbation of ETS factor binding sites in cancer[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 913. doi:10.1038/s41467-023-36535-8.

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