胞葬作用（efferocytosis）是吞噬细胞在死亡细胞发生继发性坏死前，对其进行识别、摄取和降解的过程。该过程以凋亡细胞清除最为典型，涉及吞噬细胞募集、磷脂酰丝氨酸识别、吞噬受体激活、肌动蛋白骨架重塑、吞噬体成熟、溶酶体降解及免疫代谢适应，是维持组织稳态、限制炎症扩散和促进组织修复的重要机制。

        关键词：胞葬作用；Efferocytosis；凋亡细胞；磷脂酰丝氨酸；MerTK；CD47；SIRPα；Rac1；吞噬体；LC3相关吞噬；免疫代谢

1 胞葬作用的基本特征

1.1 胞葬作用的定义

        胞葬作用主要指巨噬细胞及其他具有吞噬能力的细胞对凋亡细胞和凋亡小体进行识别、包裹及清除的过程，其主要作用是在凋亡细胞质膜明显破裂前完成清除，避免细胞发生继发性坏死并释放核酸、蛋白酶及其他损伤相关分子。胞葬作用可概括为吞噬细胞募集、死亡细胞识别与摄取、吞噬体成熟以及死亡细胞降解等连续阶段。

1.2 胞葬作用的主要执行细胞

        巨噬细胞是多数组织中承担胞葬作用的主要专职性吞噬细胞，具有较强的死亡细胞识别、内吞、降解及连续吞噬能力，树突细胞和部分其他髓系细胞也可参与死亡细胞清除。上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞及部分组织实质细胞则属于非专职性吞噬细胞，主要清除局部邻近的死亡细胞，其迁移范围和连续吞噬能力通常低于专职性吞噬细胞。

1.3 胞葬作用的生理意义

        组织更新过程中会持续产生大量死亡细胞，有效的胞葬作用能够为新生细胞提供空间，维持组织结构和细胞数量稳定，并限制死亡细胞内容物对周围细胞和细胞外基质的损伤。当死亡细胞产生速度超过吞噬细胞的清除能力时，凋亡细胞可发生继发性坏死，释放损伤相关分子模式并增加自身抗原暴露，进而促进炎症持续和自身免疫反应。

1.4 胞葬作用与其他死亡细胞清除的关系

        经典胞葬作用主要针对质膜仍相对完整的凋亡细胞，而焦亡、坏死性凋亡及其他裂解性死亡可直接破坏质膜并释放炎性内容物，吞噬细胞虽然也会清除这些死亡细胞，但其识别机制和免疫后果不能完全等同于经典胞葬作用。磷脂酰丝氨酸外翻也可出现在多种细胞死亡或应激状态中，因此单独检测磷脂酰丝氨酸不能确定死亡方式，也不能证明完整胞葬过程已经发生。

图1 胞葬作用中凋亡细胞识别、吞噬体成熟与免疫重编程机制

2 胞葬作用的核心分子机制

2.1 “Find-me”信号与吞噬细胞募集

        凋亡细胞可释放ATP和UTP等核苷酸、鞘氨醇-1-磷酸等脂质介质以及CX3CL1等趋化因子，这些可溶性信号能够形成局部浓度梯度，引导单核细胞、巨噬细胞及其他具有迁移能力的吞噬细胞向死亡细胞所在位置移动，并调节吞噬受体、细胞骨架和细胞内消化系统相关分子的表达。

2.2 Pannexin 1通道与核苷酸释放

        凋亡过程中，Caspase-3和Caspase-7可裂解并激活Pannexin 1通道，促进ATP和UTP释放到细胞外。释放的核苷酸与吞噬细胞表面的嘌呤能受体结合后，可调节细胞迁移和吞噬准备状态；胞外ATP和AMP还可进一步转化为腺苷，通过相应受体抑制部分促炎信号并促进炎症消退相关反应。

2.3 磷脂酰丝氨酸外翻

        磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）是胞葬作用中最具代表性的“Eat-me”信号。健康细胞中，PS主要分布于质膜内侧；细胞进入凋亡后，膜磷脂不对称性被破坏，PS逐渐暴露于细胞表面，使吞噬细胞能够在凋亡细胞发生继发性坏死前对其进行识别和清除。

2.4 PS的直接识别

        吞噬细胞可通过BAI1、TIM4及其他PS结合受体直接识别凋亡细胞表面的PS。BAI1与PS结合后可募集ELMO和DOCK蛋白，形成促进Rac1活化的信号复合物，从而将死亡细胞表面的识别信号传递至吞噬细胞内部，并启动肌动蛋白骨架重塑和吞噬杯形成。

2.5 PS的间接识别

        MerTK、AXL和TYRO3组成TAM受体家族，这类受体通常通过GAS6或Protein S等桥接分子间接识别PS。桥接分子的一端结合凋亡细胞表面的PS，另一端结合吞噬细胞上的TAM受体，从而促进受体活化、细胞骨架重塑和死亡细胞摄取，其中MerTK是稳态性凋亡细胞清除的重要受体。

2.6 “Don’t-eat-me”信号

        健康细胞可通过表达CD47等“Don’t-eat-me”信号避免被错误吞噬。CD47与吞噬细胞表面的SIRPα结合后，可诱导SIRPα胞质结构域磷酸化并募集SHP1和SHP2，进而抑制整合素活化、肌球蛋白收缩和吞噬杯闭合。胞葬是否发生取决于促吞噬信号、桥接分子、吞噬受体和抑制性信号之间的综合平衡。

2.7 ELMO–DOCK–Rac1信号轴

        死亡细胞识别信号可通过ELMO–DOCK复合物促进Rac1由GDP结合状态转变为GTP结合状态，活化的Rac1进一步调节WAVE、Arp2/3及其他肌动蛋白调控组分，促进局部F-actin聚合和质膜延伸。吞噬细胞质膜逐渐向死亡细胞周围扩展并形成吞噬杯，随后完成膜闭合和真正内吞。

2.8 吞噬体成熟与溶酶体融合

        吞噬杯闭合后，死亡细胞被包裹在单层膜结构中形成吞噬体。早期吞噬体可募集VPS34并获得RAB5等标志，随后逐渐转变为具有RAB7等晚期特征的吞噬体，并通过膜运输和SNARE相关机制与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，利用酸性环境、蛋白酶、核酸酶和脂肪酶降解死亡细胞成分。

2.9 LC3相关吞噬作用

        LC3相关吞噬作用（LC3-associated phagocytosis，LAP）是促进吞噬体成熟和死亡细胞降解的重要非经典自噬机制。LAP发生于含有胞外摄取底物的单层膜吞噬体，VPS34、Beclin 1、UVRAG、Rubicon及LC3连接系统可参与该过程，使LC3连接至吞噬体膜并促进其成熟及与溶酶体融合。LAP不同于经典双层膜自噬，因此不能仅根据LC3表达升高或点状聚集判定LAP增强。

3 胞葬作用的细胞学与生化表现

3.1 吞噬细胞迁移

        在“Find-me”信号作用下，吞噬细胞可出现定向迁移、膜突起延伸和死亡细胞周围聚集。迁移距离、迁移速度及吞噬细胞在死亡细胞周围的空间分布可用于评价募集阶段，但吞噬细胞到达死亡细胞附近并发生接触，不能证明死亡细胞已经被摄取。

3.2 PS外翻与质膜完整性变化

        适合胞葬实验的凋亡靶细胞通常表现为Annexin V阳性，并在早期阶段保持PI或7-AAD阴性；随着凋亡进展及继发性坏死发生，质膜通透性增加，PI或7-AAD可进入细胞。若靶细胞中膜完整性丧失的比例过高，释放的胞内物质可能直接激活吞噬细胞并干扰经典胞葬作用分析。

3.3 吞噬杯与细胞骨架变化

        吞噬受体激活后，吞噬细胞局部F-actin聚合，质膜逐渐向死亡细胞周围延伸，可形成环状或杯状肌动蛋白结构。肌动蛋白聚合受到抑制时，吞噬细胞可能仍能与死亡细胞结合，但不能完成吞噬杯闭合和内吞，因此死亡细胞黏附与真正进入吞噬细胞内部需要分别评价。

3.4 吞噬体酸化与死亡细胞降解

        死亡细胞被摄取后，吞噬体逐渐获得酸性区室特征，并与溶酶体标志物发生共定位。酸敏感探针信号增强可提示死亡细胞进入酸化吞噬体或吞噬溶酶体，但酸化不能单独证明死亡细胞已被完全降解，还应观察靶细胞荧光信号衰减、细胞结构消失及蛋白质或核酸降解。

3.5 免疫与代谢变化

        胞葬作用通常伴随IL-10等抗炎因子增加和部分促炎因子下降，同时吞噬细胞需要处理死亡细胞带来的胆固醇、脂肪酸、氨基酸和核苷酸负荷，因此可出现胆固醇外排、脂肪酸氧化、糖酵解和氨基酸代谢变化。这些指标属于胞葬后的功能输出，不能替代死亡细胞内吞和降解的直接证据。

4 胞葬作用与相关细胞清除过程的区别

5 胞葬作用的实验模型

5.1 吞噬细胞模型选择

        体外胞葬实验可选择原代巨噬细胞、外周血单核细胞诱导的巨噬细胞、骨髓来源巨噬细胞或适宜的巨噬细胞系，也可使用树突细胞、上皮细胞或成纤维细胞研究特定组织中的非专职性胞葬作用。不同细胞在MerTK、AXL、TIM4、SIRPα及其他受体表达方面存在差异，实验前应明确受体背景并统一细胞分化和培养条件。

5.2 凋亡靶细胞制备

        Jurkat T细胞及其他悬浮细胞常被用作胞葬实验的凋亡靶细胞，可通过星形孢菌素、紫外照射或其他适宜方法诱导凋亡。诱导条件应使靶细胞形成稳定PS外翻，同时尽量保持质膜完整性，避免因处理剂量过高或时间过长导致大量继发性坏死。

5.3 荧光标记与共培养

        可分别标记吞噬细胞和凋亡靶细胞，并按照设定比例进行共培养。实验应统一靶细胞与吞噬细胞比例、共培养时间、培养基体积、血清条件和洗涤步骤，同时选择胞内稳定性较好的示踪染料，避免染料泄漏或从靶细胞转移至吞噬细胞而产生假阳性。

5.4 受体与信号干预模型

        可通过阻断抗体、可溶性受体、激酶抑制剂、siRNA或基因敲除干预MerTK、AXL、CD47、SIRPα、ELMO、DOCK和Rac1等分子。干预后应同步评价吞噬细胞迁移、死亡细胞结合、真正内吞和细胞活性，避免将迁移能力下降或药物细胞毒性误判为胞葬通路抑制。

5.5 吞噬体成熟与LAP干预模型

        可通过VPS34相关信号干预、溶酶体酸化抑制、LC3检测及LAP相关分子敲低，分析吞噬体成熟和死亡细胞降解。氯喹等溶酶体干预剂可扰乱内体—溶酶体系统并阻断晚期降解通量，使吞噬体或LC3相关结构积累；此类积累不能解释为胞葬或LAP增强，而可能反映晚期融合或降解阶段受阻。

5.6 CharON活细胞追踪模型

        CharON是一种将Caspase响应型绿色荧光模块与酸敏感红色荧光模块组合的报告系统，可用于连续观察细胞凋亡、吞噬细胞募集、死亡细胞摄取及吞噬体酸化过程。绿色信号用于反映凋亡相关Caspase活化，红色信号则随死亡细胞进入酸化区室而增强，从而将死亡发生和后续清除过程连接起来。

6 胞葬作用的实验判定

6.1 凋亡靶细胞状态确认

        胞葬实验首先需要证明靶细胞处于适合清除的凋亡状态。Annexin V阳性可提示PS外翻，PI或7-AAD用于评价质膜完整性，Caspase-3/7活性和细胞核形态可进一步支持凋亡判定。较理想的靶细胞群体应具有较高的Annexin V阳性比例，同时控制PI或7-AAD阳性细胞比例。

6.2 表面结合与真正内吞的区分

        流式细胞术检测到吞噬细胞和靶细胞双阳性，只能说明两类细胞发生了接触、结合或荧光信号共存，不能直接证明死亡细胞进入吞噬细胞内部。可采用共聚焦显微镜层扫、三维重建、胞外荧光淬灭、差异染色或酸洗等方法，区分吞噬细胞表面的死亡细胞与胞内吞噬体中的死亡细胞。

6.3 胞葬效率与连续吞噬能力

        胞葬效率可通过摄取至少一个凋亡细胞的吞噬细胞比例、每个吞噬细胞内的死亡细胞数量、吞噬细胞内靶细胞荧光强度及单位时间内死亡细胞清除速度进行评价。吞噬细胞阳性比例主要反映是否发生摄取，每个吞噬细胞内的靶细胞数量则更适合评价吞噬负荷和连续胞葬能力。

6.4 吞噬体成熟与降解验证

        可采用酸性区室探针、溶酶体标记、靶细胞荧光信号衰减和降解产物变化评价吞噬体成熟。死亡细胞与LysoTracker等探针共定位可支持其进入酸性区室，但不能单独证明完全降解，还应进一步观察靶细胞结构消失、内容物降解及吞噬细胞后续清除能力。

6.5 吞噬受体依赖性验证

        可通过MerTK、AXL、BAI1、TIM4或CD47–SIRPα通路干预，判断相应受体在特定细胞模型中的作用。受体表达与胞葬效率相关只能提供关联证据，确认因果关系还需采用受体阻断、药理抑制、基因敲低或基因敲除，并在排除细胞毒性后观察胞葬表型是否发生一致变化。

6.6 LAP依赖性验证

        LAP判定需要证明LC3被募集至含死亡细胞的单层膜吞噬体，并且该过程影响吞噬体成熟和死亡细胞降解。LC3-II升高、LC3点状聚集或LC3与溶酶体共定位均不能单独区分LAP与经典自噬，应结合死亡细胞定位、吞噬体结构、LAP相关分子干预和降解功能综合判断。

6.7 免疫与代谢输出检测

        可检测IL-10、TNF-α、IL-1β及其他炎症因子，评价胞葬后的免疫状态变化，同时检测ABCA1、胆固醇、ATP和能量代谢相关指标，评价吞噬细胞对死亡细胞代谢负荷的适应。免疫因子和代谢指标变化应建立在死亡细胞已被真正摄取的基础上，不能单独用于判定胞葬作用。

7 胞葬作用的调控因素

7.1 “Eat-me”与“Don’t-eat-me”信号平衡

        胞葬效率取决于PS、钙网蛋白等促吞噬信号与CD47等抑制性信号之间的平衡。促吞噬信号增加并不一定能够克服强烈的CD47–SIRPα抑制，阻断CD47也不能在缺乏有效促吞噬信号时自动触发完整吞噬，因此不同细胞模型对相同干预的反应可能存在明显差异。

7.2 死亡细胞负荷与连续胞葬

        组织中的死亡细胞数量可能高于吞噬细胞数量，单个巨噬细胞往往需要连续清除多个凋亡细胞。死亡细胞负荷过高可造成吞噬细胞体积增加、溶酶体负担加重和后续摄取能力下降，因此连续胞葬既依赖肌动蛋白骨架恢复，也依赖摄入脂质、蛋白质和核酸的及时处理。

7.3 胆固醇处理与ABCA1

        凋亡细胞膜含有大量胆固醇和磷脂，死亡细胞摄取后可促进吞噬细胞ABCA1表达和胆固醇外排，从而限制脂质超载并维持连续清除能力。若胆固醇外排不足，吞噬细胞可能发生脂质积累，影响膜结构、溶酶体功能和后续胞葬。

7.4 脂肪酸氧化与IL-10表达

        死亡细胞来源的脂质可进入吞噬细胞脂肪酸代谢，脂肪酸氧化和线粒体代谢变化可与IL-10表达及炎症消退功能相联系。脂肪酸氧化变化应与死亡细胞摄取量、线粒体功能和细胞存活状态联合分析，不能单独作为胞葬增强的证据。

7.5 炎症环境与吞噬细胞状态

        促炎细胞因子、病原体信号和氧化应激可改变吞噬受体表达、细胞骨架状态和溶酶体功能，不同激活状态的巨噬细胞在迁移、死亡细胞识别和连续吞噬能力方面可能存在明显差异。实验中应统一巨噬细胞分化条件、刺激时间、培养密度和血清来源。

8 疾病研究与靶向潜力

8.1 自身免疫性疾病

        胞葬不足可导致凋亡细胞和细胞残骸积累，增加核酸及其他自身抗原暴露，继发性坏死释放的损伤相关分子可激活先天免疫并促进自身抗体产生。系统性红斑狼疮等疾病中的死亡细胞清除缺陷，可能同时涉及死亡细胞产生增加、吞噬受体异常、溶酶体处理不足和免疫耐受破坏。

8.2 动脉粥样硬化

        动脉粥样硬化斑块中存在大量凋亡的巨噬细胞、泡沫细胞和平滑肌细胞，早期阶段的有效胞葬可限制细胞残骸积累，而进展期斑块中的胞葬缺陷可促进继发性坏死和坏死核心形成。MerTK功能异常、吞噬细胞脂质超载和ABCA1介导的胆固醇外排不足，均可能加重斑块炎症和不稳定性。

8.3 神经退行性疾病与视网膜变性

        小胶质细胞和其他神经系统吞噬细胞需要持续清除死亡神经元、突触结构和髓鞘碎片，胞葬不足可能导致细胞残骸和炎症介质积累并干扰神经组织修复。视网膜色素上皮细胞和视网膜相关吞噬细胞同样承担持续清除任务，吞噬体成熟或溶酶体降解异常可导致未降解物质积累并促进视网膜退行性改变。

8.4 肿瘤免疫微环境

        肿瘤组织中存在大量因缺氧、营养不足或治疗而死亡的细胞，巨噬细胞清除这些细胞可减少继发性坏死，但也可能促进IL-10等抗炎信号并形成免疫抑制性微环境。肿瘤细胞还可通过高表达CD47抑制巨噬细胞吞噬，因此CD47–SIRPα、TAM受体和LAP相关通路均是肿瘤免疫研究的重要方向。

8.5 靶向干预策略

        在自身免疫、慢性炎症和动脉粥样硬化中，可研究增强PS识别、改善MerTK信号、促进吞噬体降解及恢复吞噬细胞代谢适应的策略；在肿瘤中，则可能需要阻断CD47–SIRPα、调节TAM受体信号或改变免疫抑制性死亡细胞处理。不同疾病中的干预方向可能相反，需要根据疾病阶段、吞噬细胞类型和免疫终点设计实验。

9 产品

9.1 凋亡靶细胞制备与状态检测产品

9.2 胞葬受体与识别信号研究产品

9.3 Rac1与肌动蛋白骨架研究产品

9.4 吞噬体、溶酶体与LC3相关研究产品

9.5 炎症与免疫代谢检测产品

        胞葬作用研究应同时确认凋亡靶细胞状态、吞噬细胞募集和死亡细胞识别，区分表面结合与真正内吞，并进一步验证吞噬体酸化、溶酶体融合和死亡细胞降解。只有将受体依赖性、肌动蛋白骨架重塑、LAP相关机制及免疫代谢输出纳入同一证据链，才能准确评价胞葬作用在组织稳态、炎症消退和疾病进展中的功能。

参考文献

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