1 方法定位

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立Papanicolaou EA36体系在宫颈细胞学标本中的固定、水化、核染、胞浆分色、脱水透明与封片操作流程。适用样本包括宫颈脱落细胞常规涂片及经实验室验证的液基细胞学制片，主要用于宫颈细胞学筛查、宫颈上皮病变相关形态观察及常规细胞学实验染色。

1.2 操作重点

（1）标本类型以宫颈涂片和宫颈液基细胞学制片为主，染色参数应以宫颈上皮细胞分色、核结构清晰度和背景清洁度作为调整依据。

（2）胞浆复染步骤采用EA36，重点控制表层细胞、中层细胞、柱状上皮细胞及炎性背景之间的分色层次。

（3）固定、水化、分化、蓝化、OG6初染、EA36复染和终末脱水应按固定时间点执行，便于批内一致性管理。

1.3 染色质量目标

（1）细胞核呈蓝色至深蓝色，核膜、核仁及染色质颗粒结构清晰。

（2）角化细胞胞浆呈橘黄色，非角化鳞状上皮和柱状上皮细胞呈粉红、蓝绿或绿色等差异色调。

（3）背景清洁，黏液、炎细胞和红细胞不应明显掩盖上皮细胞结构；制片透明度应支持重叠细胞区域的轮廓观察。

2 样本、固定与染液准备

2.1 样本要求

（1）常规宫颈涂片应在取材后立即均匀推片或涂片，细胞层不宜过厚，片面不应出现大片黏液覆盖或明显血液凝块。

（2）液基细胞学制片应确认细胞附着良好，染色前不得长时间暴露于空气中；如前处理导致细胞附着不足，后续乙醇梯度和流水冲洗均可能增加脱片风险。

（3）染色前应剔除破损载玻片、标签污染片和明显干片；已经发生空气干燥的人为变性制片不宜作为染色参数优化的依据。

2.2 固定体系

（1）常规涂片建议采用95%乙醇-冰乙酸固定液固定10～15min；固定液应完全覆盖细胞区域，避免片面边缘残留空气。

（2）固定后不能立即染色时，应继续浸于合适浓度乙醇中保存，不宜取出后暴露干燥。

（3）固定液使用过程中应关注乙醇浓度下降、染色残留和水分带入；固定液混浊、气味异常或反复使用时间过长时应及时更换。

2.3 染液与工作液检查

（1）苏木素染液使用前应观察是否存在金属光泽、沉淀或结晶；必要时过滤后使用。

（2）分化液和蓝化液应每日或按使用量更换；分化液效力下降会造成核染偏深，蓝化不足会影响核色稳定性和后续胞浆分色。

（3）橘黄G6和EA36染色液应保持澄清，瓶口避免长时间敞开；若出现明显沉淀、整体偏色或批间分色不稳定，应先用质控片确认后再处理正式样本。

（4）乙醇梯度和二甲苯应保持洁净。水分带入无水乙醇或二甲苯后，制片容易发雾、背景发灰或封片后出现透明度下降。

3 标准操作流程

3.1 固定与水化

（1）细胞涂片制备后立即置入95%乙醇-冰乙酸固定液中固定10～15min。

（2）取出制片后依次置于95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中，各1min。

（3）转入蒸馏水或自来水中浸泡或冲洗1min，使制片进入适合苏木素核染的水化状态。

3.2 核染色、分化与蓝化

（1）将水化后的制片置于经验证适用的苏木素染液中染色5～10min。染色时间应依据染液新旧、温度和质控片核染强度微调。

（2）苏木素染色后以自来水冲洗2min，去除表面浮色。

（3）使用1%盐酸乙醇分化液分化约4～5s，或使用0.5%盐酸水溶液分化约10s；分化后立即冲洗2min，避免持续脱色。

（4）转入蓝化液中蓝化2min，再以自来水冲洗2min。蓝化完成后细胞核应由红紫色转为稳定蓝色。

3.3 胞浆染色前脱水

（1）将制片依次置于70%乙醇、80%乙醇中各2min。

（2）再置于95%乙醇（Ⅰ）和95%乙醇（Ⅱ）中各2min。该步骤用于将制片调整至适合OG6和EA36胞浆染色的乙醇环境。

3.4 橘黄G6初染

（1）将制片置于橘黄G6染液中染色2min。

（2）染色后依次置于95%乙醇（Ⅰ）和95%乙醇（Ⅱ）中各2min，去除多余橘黄G6，避免角化胞浆过强或背景橘黄色残留。

3.5 EA36复染

（1）将制片置于EA36染色液中染色3～5min。宫颈细胞量较多或背景较厚时，可先以质控片确认是否需要靠近上限时间。

（2）EA36染色后置于95%乙醇（Ⅰ）和95%乙醇（Ⅱ）中各1min。该步骤既用于去除浮色，也直接影响粉红、蓝绿和绿色调之间的平衡，不宜随意延长。

3.6 终末脱水、透明与封片

（1）将制片置于无水乙醇（Ⅰ）和无水乙醇（Ⅱ）中各1min，完成终末脱水。

（2）转入二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）中透明，各约2min；二甲苯混浊、带水或着色时应更换。

（3）滴加中性树胶，覆盖盖玻片，避免气泡、胶量不足或胶液外溢。封片后待胶液稳定再进行显微镜观察或归档。

表1Papanicolaou EA36宫颈细胞学染色关键步骤与控制点

4 染色结果与接收标准

4.1 细胞核

（1）合格制片中，细胞核应呈蓝色至深蓝色，核边界清楚，核仁和染色质颗粒可辨。

（2）核染过浅时，异型细胞核细节容易被低估；核染过深时，细颗粒状染色质和核膜不规则性可能被掩盖。

4.2 胞浆分色

（1）角化细胞应以橘黄色为主，提示OG6初染有效且后续乙醇处理未过度脱色。

（2）表层鳞状上皮、中层鳞状上皮、柱状上皮及炎性背景之间应形成可区分色调；EA36分色不足时，胞浆常表现为偏淡、偏灰或层次不清。

（3）若整片偏红、偏蓝绿或综合色失衡，应优先复查EA36染色时间、95%乙醇漂洗时间和染液使用状态。

4.3 背景与透明度

（1）背景应清洁，黏液、炎细胞和红细胞不应明显遮盖上皮细胞核结构。

（2）透明度不足时，制片发灰或发雾，细胞重叠区域层次变差；此时应检查无水乙醇是否带水、二甲苯是否混浊及封片胶是否合适。

表2EA36宫颈细胞学染色结果判读要点

5 关键控制点

5.1 湿固定与细胞附着

（1）宫颈细胞学制片对固定时机敏感，空气干燥会同时影响核染、胞浆透明度和EA36分色。

（2）液基制片若细胞附着较弱，应避免过强流水冲洗和不必要的长时间乙醇处理；同批样本应保持一致的固定和转缸节奏。

5.2 分化与蓝化

（1）分化时间应以秒级控制，不宜用肉眼粗略延长。分化不足会造成核染偏深和胞浆偏灰紫；分化过度会造成核细节减弱。

（2）蓝化不足时，核色不稳定，并可能影响后续EA36综合色调；蓝化后必须充分冲洗，避免碱性残留干扰胞浆染色。

5.3 EA36染色与乙醇漂洗

（1）EA36染色时间通常控制在3～5min，不建议直接套用EA50或EA65的实验室经验。

（2）EA36后95%乙醇处理既会去除浮色，也会改变胞浆综合色调；处理不足会背景偏深，处理过强会胞浆偏淡或分色消失。

（3）同一批宫颈制片应尽量使用同一批次EA36、相同染色时间和相同转缸节奏，以减少批间色差。

6 常见问题与处理

表3Papanicolaou EA36宫颈细胞学染色常见问题排查

7 质控与记录

7.1 质控片设置

（1）每次更换苏木素、OG6、EA36、分化液或蓝化液后，建议先染质控片，确认核染强度和胞浆分色后再处理正式样本。

（2）质控片应包含角化细胞、非角化鳞状上皮细胞、柱状上皮细胞及一定背景成分，以便同时评价OG6和EA36的综合色调。

7.2 批内一致性记录

（1）记录固定时间、苏木素染色时间、分化方式、蓝化时间、OG6时间、EA36时间、乙醇与二甲苯更换日期。

（2）同批次出现系统性偏色时，应优先从染液批次、乙醇梯度、分化液效力和操作节奏四个方面排查。

8 Papanicolaou EA36宫颈细胞学染色相关试剂与材料选型

表4Papanicolaou EA36宫颈细胞学染色相关试剂与材料选型

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[1] 巴氏染色