1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立常规巴氏染色操作流程，适用于宫颈涂片、阴道细胞学标本、非妇科脱落细胞学标本、细针穿刺细胞学标本及部分体液细胞学标本的常规染色与形态学观察。

1.2 原理简介

（1）巴氏染色以湿固定为基础，通过95%乙醇快速固定细胞，尽可能保持细胞内蛋白、脂质及核染色质结构稳定，减少空气干燥导致的人为变性。

（2）苏木素主要用于细胞核染色，使核膜、染色质及核仁结构更加清晰。

（3）橘黄G（OG）用于角化胞浆及嗜酸性结构初染，可使角化细胞呈橘黄色。

（4）EA染液为复合胞浆染液，常用EA50或EA36，可使不同类型细胞胞浆呈现绿色、蓝绿色或粉红色调，从而提高细胞分型和异常细胞识别能力。

1.3 染色质量要求

（1）细胞核结构清晰，染色质分布可辨。

（2）细胞透明度高，细胞重叠时仍能观察轮廓和层次。

（3）胞浆分色恰当，角化与非角化成分具有较好区分度。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）宫颈或阴道脱落细胞涂片。

（2）非妇科脱落细胞学标本涂片。

（3）细针穿刺细胞学涂片。

（4）脑脊液、胸腹水等细胞学制片。

2.2 主要试剂

（1）95%乙醇固定液。

（2）蒸馏水或去离子水。

（3）苏木素染液。

（4）分化液，可采用酸性酒精体系。

（5）蓝化液，可采用饱和碳酸锂或3%氨水。

（6）橘黄G染液（OG或OG6）。

（7）EA染液，可采用EA50、EA36或适配标本类型的改良EA染液。

（8）95%乙醇。

（9）无水乙醇。

（10）二甲苯。

（11）中性树胶。

2.3 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）固定缸、染色缸。

（3）镊子、吸水纸。

（4）显微镜。

（5）密封样本盒或邮寄盒。

3 染液与样本准备

3.1 固定液准备

（1）固定液宜使用95%乙醇。

（2）使用后的固定液应过滤后再使用。

（3）固定液使用时间过长后，应检测酒精浓度；当浓度低于90%时应及时更换。

3.2 染液准备

（1）苏木素染液使用前应过滤，避免结晶或沉淀影响染色质量。

（2）EA染液应根据标本类型选择合适配方。妇科标本通常使用EA36或EA50，非妇科标本可根据实验室经验采用EA65或改良EA。

（3）若EA染液分色异常，偏红时可少量加入磷钨酸调整；偏蓝或偏绿时可少量加入饱和碳酸锂调整。

（4）改良EA染液可根据体系需要加入少量冰醋酸，以改善染色效果并提高染液稳定性。

3.3 样本制片要求

（1）制片完成后必须立即进行湿固定，不得空气干燥。

（2）如需转运标本，可固定15 min后取出，在片面滴加少量甘油并密封保存；实验室收到后先置于95%乙醇中去除甘油，再进入染色流程。

（3）固定前或固定后如发生制片干燥，均会影响核染和胞浆分色效果。

4 实验流程

4.1 固定

（1）细胞学涂片制备完成后，趁标本仍处于湿润状态，立即放入95%乙醇固定液中。

（2）固定时间一般不少于15～30 min。

（3）常规染色时，固定时间通常不超过1周。

（4）如固定液浓度不足或固定不及时，可能导致细胞人为变性，影响后续形态学判断。

4.2 核染色

（1）将固定后的制片取出，经清水冲洗数次，去除表面固定液。

（2）置于苏木素染液中染色3～5 min。具体时间应根据季节、染液新旧程度和染色强度适当调整。

（3）夏季或放置较久的苏木素染液着色较快，染色时间宜适当缩短；冬季或新配制染液着色较慢，时间可适当延长。

（4）核染色可采用两种策略：

①过染法：先有意识加深核染，再经分化调整至合适程度，适用于黏液较多或背景较杂的标本。

②淡染法：严格控制苏木素染色时间，使核染色恰当而不经明显分化，适用于黏液较少、细胞较易脱落的标本。

4.3 分化与蓝化

（1）如采用过染法，苏木素染后可短暂置于分化液中，使核染色减弱至合适程度，并去除胞浆中过量苏木素残留。

（2）分化后立即清水冲洗。

（3）将制片置于蓝化液中数秒，使细胞核由红紫色转为清晰蓝色。

（4）蓝化后需充分流水冲洗，以避免碱性残留影响后续胞浆着色及长期保存效果。

（5）分化液和蓝化液至少每日更换一次。

4.4 胞浆染色

（1）将制片置于95%乙醇中漂洗。

（2）置于橘黄G染液中染色。常规时间一般较短，通常为数秒至1～2 min，不宜过长。

（3）经95%乙醇漂洗1～2次，去除多余橘黄G。

（4）必要时经100%乙醇短暂过渡。

（5）再置于EA染液中染色3～5 min。

（6）EA染色后，经95%乙醇漂洗2次，以去除浮色并稳定胞浆分色。

4.5 脱水、透明与封片

（1）经无水乙醇漂洗或脱水。

（2）置于无水乙醇中继续脱水约2 min。

（3）转入二甲苯透明约2 min；若二甲苯出现浑浊或染色，应及时更换。

（4）滴加中性树胶，覆盖盖玻片，完成封片。

（5）封片后应避免产生气泡，并保持胶液分布均匀。

5 参考操作顺序

        95%乙醇固定（15 min）→清水冲洗→苏木素染液（3～5 min）→清水冲洗→分化（按需要）→清水冲洗→蓝化→清水冲洗→95%乙醇漂洗→橘黄G染液（数秒至1～2 min）→95%乙醇漂洗→EA50或EA36（3～5 min）→95%乙醇漂洗→无水乙醇脱水→二甲苯透明→中性树胶封片

6 结果判读要点

6.1 细胞核

（1）核边界清晰，染色质分布可辨，核膜与核仁形态较易识别。

（2）如核染过浅，异型核的细节不易显示；如核染过深，则可能掩盖染色质颗粒结构。

6.2 胞浆

（1）角化细胞胞浆多呈橘黄色。

（2）非角化鳞状上皮或其他细胞胞浆可表现为绿色、蓝绿色或粉红色。

（3）分色理想时，细胞类型之间应有较好的色调区分。

6.3 透明度

（1）制片透明度高时，重叠细胞仍可辨认轮廓和层次。

（2）若脱水或透明不足，制片易发灰、发雾，影响镜下判读。

7 质控要点

7.1 固定质量控制

（1）湿固定是巴氏染色成败的关键步骤。

（2）固定不足、固定液浓度下降或制片干燥，均可导致核结构失真、胞浆分色异常，甚至影响诊断准确性。

7.2 染液质量控制

（1）苏木素应每日过滤。

（2）EA染液颜色、澄清度及pH状态应定期检查。

（3）二甲苯和乙醇若出现污染、着色或浑浊，应及时更换。

7.3 操作一致性控制

（1）同批标本应尽量使用一致的染色时间和更换节奏。

（2）不同季节、不同批次染液和不同标本类型，应通过预实验或经验微调染色时间。

8 常见问题与原因分析

8.1 核染过浅

（1）苏木素染色时间不足。

（2）分化时间过长。

（3）固定前制片已干燥。

（4）蓝化不足或流水冲洗不充分。

8.2 核染过深

（1）分化不充分。

（2）分化液浓度不足。

（3）使用高于95%的酒精固定后，可能导致染色偏深。

8.3 胞浆淡染

（1）OG或EA染色时间不足。

（2）染液老化或浓度下降。

（3）乙醇漂洗过强，造成浮色和有效染色成分过度脱除。

8.4 胞浆不分色或偏灰紫

（1）固定前制片干燥。

（2）苏木素染色过重或分化不佳，残留苏木素干扰胞浆着色。

（3）标本中存在较多黏液或细菌，影响染液进入和分色质量。

8.5 EA染色偏色

（1）若整体偏红，可少量加入磷钨酸纠正。

（2）若整体偏蓝或偏绿，可少量加入饱和碳酸锂纠正。

（3）改良EA染液中适当加入冰醋酸，有助于改善染色效果并延长使用稳定性。

9 应用范围

9.1 常规细胞学筛查

（1）宫颈及阴道细胞学筛查。

（2）脱落细胞学检查。

9.2 非妇科细胞学标本

（1）甲状腺细针穿刺细胞学。

（2）卵巢肿瘤细针穿刺细胞学。

（3）脑脊液等体液细胞学检查。

9.3 扩展与自动化应用

（1）巴氏染色可与液基细胞制片结合使用。

（2）在自动化细胞学平台中，可实现固定、染色、封片等工序的标准化操作。

10 安全与操作规范

10.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理乙醇、二甲苯及染液时应在通风条件良好的环境下操作。

10.2 废液处理

（1）含酒精、二甲苯及染色残液的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品与生物样本处理规范处置。

11 巴氏染色关键试剂与材料选型

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[1] 巴氏染色