酚法核酸提取通过样品裂解、蛋白质变性和水相—有机相分配，使DNA或RNA与蛋白质、脂质及细胞碎片分离。中性或弱碱性酚体系通常用于DNA和总核酸提取，酸性胍盐—酚体系主要用于RNA选择性提取。酚试剂pH、裂解液组成、样品负载量和界面转移操作共同影响核酸的产量、纯度与完整性。

        关键词：酚法提取；DNA提取；RNA提取；酚—氯仿；异戊醇；酸性酚；异硫氰酸胍；液液分配；核酸纯化；质量控制

1 酚法核酸提取的基本原理与技术特点

1.1 样品裂解与核酸释放

        DNA和RNA在细胞内分别与组蛋白、核糖体蛋白及其他核酸结合蛋白形成复合物，提取时需要先破坏细胞膜、细胞器膜或细胞壁，并使核蛋白复合物解离。DNA提取常采用去污剂、EDTA和蛋白酶K完成裂解与蛋白质消化；RNA提取通常使用异硫氰酸胍等强变性剂，在裂解样品的同时快速失活RNase。裂解不足会降低核酸回收率，机械处理过强则可能导致高分子量DNA剪切。

1.2 蛋白质变性与核酸分配

        酚能够破坏蛋白质内部的氢键和疏水相互作用，使蛋白质失去天然构象并降低其在水相中的溶解度。离心分相后，核酸根据体系pH、盐浓度和分子性质进入水相或界面，变性蛋白质和细胞碎片主要聚集于界面，脂质及其他疏水性物质进入有机相。

1.3 酚法提取的技术特点

        酚法对蛋白质和脂质的去除能力较强，适合高蛋白、高脂质或成分复杂的样品，也可用于高分子量基因组DNA和总RNA提取。其主要限制是操作步骤较多，水相转移容易引入界面污染，残留酚、氯仿、胍盐或乙醇会抑制PCR、逆转录、酶切、连接和测序文库构建。酚和氯仿具有毒性及挥发性，应在通风条件下操作并分类处理废液。

2 酚、氯仿与异戊醇在液液分相中的作用

2.1 酚的蛋白质变性作用

        酚是分相体系中的主要蛋白质变性组分，可使组蛋白、膜蛋白及核酸酶展开并进入有机相或界面，从而释放与蛋白质结合的核酸。酚长期接触空气和光照可能发生氧化，氧化产物会增加核酸损伤和下游反应抑制风险，因此核酸提取用酚应避光、密封并按照规定条件保存。

2.2 氯仿与异戊醇的辅助作用

        氯仿可提高有机相密度，促进水相与有机相形成清晰界面，并增强脂质和疏水性杂质向有机相的分配。酚抽提后的水相还可使用氯仿再次处理，以降低残留酚。异戊醇主要用于减少泡沫和乳化，改善分层稳定性。常见酚—氯仿—异戊醇体积比为25∶24∶1，氯仿—异戊醇体系常采用24∶1，实际比例应以具体方法和试剂配方为准。

2.3 分相结果与水相转移

        离心后，上层水相主要含核酸和水溶性组分，下层有机相主要含酚、氯仿、脂质和疏水性物质，中间界面富集变性蛋白质、细胞碎片及部分核酸。转移水相时应沿液面缓慢吸取，并保留少量液体覆盖界面。吸取过深虽然可能提高表观回收率，但会增加蛋白质、基因组DNA和有机试剂污染。

3 酚试剂pH对DNA与RNA分配行为的影响

3.1 中性或弱碱性酚体系

        在pH约7.5～8.0的中性或弱碱性体系中，DNA和RNA通常均保持较好的水溶性，主要进入上层水相，蛋白质则分布于界面和有机相。因此，中性或弱碱性酚常用于基因组DNA、质粒DNA及总核酸提取。以DNA为目标时，水相中共提取的RNA通常需要通过RNase处理去除。

3.2 酸性酚体系

        酸性酚通常与异硫氰酸胍和氯仿共同构成RNA提取体系。在酸性和高离子强度条件下，RNA主要保留于水相，高分子量DNA更多分布于界面和有机相，蛋白质则被胍盐和酚充分变性。酸性分相不能完全排除DNA，短DNA片段、样品过载或界面扰动仍可能导致基因组DNA进入水相。

3.3 核酸分配的综合影响因素

        DNA与RNA的分配并非仅由pH决定，还受到核酸分子长度、构象、水合状态、盐浓度、胍盐含量和样品蛋白质组成影响。酸性RNA提取酚用于基因组DNA提取时可能降低DNA回收率，中性DNA提取酚用于RNA提取时则容易增加DNA共提取，因此酚试剂的缓冲状态应与目标核酸和提取体系相匹配。

4 DNA提取酚体系的组成、操作流程与关键控制

4.1 DNA提取体系的组成

        DNA酚法提取体系通常包括Tris缓冲液、EDTA、去污剂、蛋白酶K、中性或弱碱性酚、氯仿和异戊醇。Tris用于维持适宜pH，EDTA通过螯合Mg²⁺和Ca²⁺抑制核酸酶，去污剂破坏细胞膜并使蛋白质变性，蛋白酶K进一步降解组蛋白、膜蛋白和核酸酶。

4.2 DNA酚法提取流程

        样品在裂解液中充分裂解并完成蛋白酶K消化后，加入中性酚或酚—氯仿—异戊醇混合液，轻柔混匀并离心分相。上层水相转移至新容器后，可再使用氯仿—异戊醇抽提以去除残留酚。水相中的DNA随后通过盐和乙醇或异丙醇沉淀，经70%～75%乙醇洗涤后适度干燥，并使用TE缓冲液或无核酸酶水复溶。

4.3 高分子量DNA的完整性控制

        提取高分子量基因组DNA时，应减少高速涡旋、反复吹打和窄口吸头造成的机械剪切，裂解后的黏稠溶液宜采用缓慢颠倒方式混匀。增加抽提次数虽然能够改善蛋白质去除，但也会增加DNA剪切和水相转移损失，应根据样品蛋白质含量控制抽提次数。

4.4 DNA提取中的常见问题

        DNA得率偏低通常与样品裂解不足、水相转移损失或醇沉淀不完全有关；A260/A280偏低常提示蛋白质或酚污染，A260/A230偏低则可能与酚、盐类、EDTA或乙醇残留有关。DNA样品中RNA含量过高时可使用RNase A处理，处理后应根据下游应用进行再次纯化。

5 RNA提取酚体系的组成、操作流程与关键控制

5.1 RNA提取体系的组成

        RNA酚法提取通常采用异硫氰酸胍、酸性酚和氯仿组成的强变性体系。异硫氰酸胍可破坏细胞结构、解离核蛋白复合物并迅速失活RNase，酸性酚和氯仿则促进RNA与DNA、蛋白质和脂质分离。部分体系还含有乙酸盐、表面活性剂或还原剂，用于维持酸性条件并增强RNase失活。

5.2 RNA酚法提取流程

        样品应立即加入足量裂解试剂并充分匀浆，使组织完全分散并快速失活RNase。裂解液加入氯仿后充分混匀并离心分相，上层水相含RNA，界面和有机相主要含DNA、蛋白质及脂质。水相转移至新容器后加入异丙醇或乙醇沉淀RNA，沉淀经乙醇洗涤、适度干燥后使用无RNase水复溶。

5.3 RNase污染与样品保存

        RNA提取应使用无RNase耗材、溶液和操作环境，样品离体后应立即裂解、液氮冷冻或使用RNA稳定试剂保存。操作延迟、裂解液不足、样品反复冻融和器具污染均可能造成RNA降解。提取后的RNA宜分装低温保存，避免反复冻融。

5.4 RNA提取中的DNA污染

        RNA样品中的基因组DNA污染常由样品过载、匀浆不充分、水相吸取过深或界面扰动引起。用于逆转录定量PCR和转录组分析的RNA通常需要进行DNase I处理，并通过无逆转录对照判断DNA残留。DNase处理后还应去除酶、金属离子和反应缓冲液。

5.5 RNA沉淀与复溶

        低浓度RNA在醇沉淀过程中容易损失，可通过延长沉淀时间或加入适宜共沉淀剂提高回收率。乙醇洗涤不足会残留胍盐和盐类，沉淀过度干燥则会使RNA难以复溶。RNA复溶时宜轻柔混匀，避免长时间高温处理。

6 DNA提取酚与RNA提取酚的方法差异及选择依据

6.1 DNA与RNA酚法提取的主要差异

6.2 提取体系的选择

        需要获得高分子量基因组DNA、进行长片段扩增或长读长测序时，应选择中性或弱碱性酚体系，并减少机械剪切。需要提取总RNA并用于逆转录定量PCR、转录组测序或Northern blot时，应选择酸性胍盐—酚体系。需要从同一样品中分别回收DNA、RNA和蛋白质时，可采用多组分分层提取体系；低起始量、高通量或需要自动化处理的样品则通常更适合柱式或磁珠法。

7 不同样品中酚法提取条件的调整

7.1 培养细胞与动物组织

        培养细胞可直接加入裂解液完成核酸释放，动物组织则需根据组织质量和结构进行机械匀浆。脂肪组织容易形成脂质层和乳化层，应减少起始量并增加裂解液或有机相用量；肌肉、皮肤和结缔组织可通过延长蛋白酶K消化或加强匀浆改善裂解。

7.2 血液、血浆与微量样品

        全血DNA提取需去除血红蛋白、血浆蛋白和抗凝剂，必要时可先进行红细胞裂解或白细胞富集。血浆、血清和少量细胞中的核酸浓度较低，水相转移和醇沉淀造成的损失比例较高，可加入糖原等共沉淀剂并减少不必要的转移步骤。

7.3 细菌、真菌与酵母

        革兰氏阳性菌、真菌和酵母具有较厚细胞壁，需要使用溶菌酶、裂解酶、玻璃珠或机械研磨辅助破壁。微生物RNA提取应在破壁后立即进入强变性胍盐—酚体系，以减少RNA降解和转录状态变化。提取高分子量细菌基因组DNA时，应避免过度震荡造成DNA剪切。

7.4 植物组织

        植物组织含有多糖、多酚、色素和细胞壁成分，容易造成核酸共沉淀和下游酶反应抑制。富含多糖的样品可采用高盐或CTAB体系，富含多酚的样品可加入聚乙烯吡咯烷酮和还原剂。植物RNA提取通常需要在液氮条件下充分研磨，并迅速加入胍盐—酚裂解液。

7.5 固定组织与降解样品

        甲醛固定石蜡包埋组织中的核酸可能发生交联、断裂和碱基修饰，需要经过脱蜡、蛋白酶消化和交联逆转后再进行纯化。酚抽提能够去除蛋白质和部分杂质，但不能恢复已经断裂的核酸，因此应根据核酸片段长度选择短扩增子PCR、靶向测序或适合降解RNA的建库方法。

8 酚残留、核酸降解与提取质量评价

8.1 核酸浓度与纯度

        核酸浓度可采用紫外吸收法或荧光法测定。紫外法操作方便，但酚、游离核苷酸和其他吸光物质可能造成浓度高估；荧光法对DNA或RNA的选择性较高，更适合低浓度和复杂样品。纯DNA的A260/A280通常接近1.8，纯RNA通常接近2.0，A260/A230一般以约2.0～2.2为宜，但低浓度样品的吸光度比值波动较大，不能单独作为质量判定依据。

8.2 DNA与RNA完整性

        基因组DNA可通过琼脂糖凝胶电泳或片段分析评价，高分子量DNA应以高分子区域集中信号为主，明显拖尾提示机械剪切或核酸酶降解。RNA可通过核糖体RNA条带、电泳图谱、RNA完整性数值或DV200评价，RNA降解会降低逆转录效率并影响转录组覆盖度和表达定量。

8.3 有机试剂与盐类残留

        酚残留会影响A260/A280和A260/A230比值，并抑制聚合酶、逆转录酶、连接酶和限制性内切酶，可通过氯仿再次抽提或柱式、磁珠式二次纯化去除。胍盐和乙醇残留通常与洗涤不足或沉淀干燥不充分有关，也会显著抑制下游酶反应。

8.4 下游功能验证

        用于PCR的DNA应评价扩增效率和非特异性产物，用于酶切、克隆或测序的DNA应验证消化、连接和文库构建性能。RNA样品应结合内参基因扩增、逆转录效率和无逆转录对照判断DNA污染及反应抑制。提取过程中还应设置空白对照，以识别试剂、耗材和环境引入的核酸污染。

9 DNA与RNA酚法提取相关产品

9.1 DNA与RNA提取及辅助产品

9.2 酚法核酸提取相关化学试剂

        DNA与RNA酚法提取应根据目标核酸、样品性质和下游应用选择体系，并重点控制酚试剂pH、界面转移及有机试剂残留。

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[1] 核酸提取的黄金搭档：RNase A与蛋白酶K

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