引言

        药物化学中，分子量、脂溶性、氢键供体和受体数量等理化性质，常用于评估化合物发生低溶解度或低膜通透性的风险。Lipinski五规则（Rule of Five，Ro5）建立了经典口服小分子药物的经验性理化性质范围，并提示当分子量、脂溶性及氢键相关参数明显增加时，较差吸收或渗透的风险通常随之升高[1]。

        随着药物发现逐渐进入超越五规则（beyond Rule of Five，bRo5）的化学空间，传统二维理化参数与膜通透性之间的关系变得更加复杂。宏环、环肽以及蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera，PROTAC）等分子往往具有较大的分子尺寸和较多极性官能团，但一些bRo5药物和候选化合物仍表现出可观的膜通透性[4,5]。

        这一现象并不意味着经典理化规律失效。对于构象复杂的bRo5分子，需要进一步考虑一个三维层面的问题：二维结构中包含的极性，与分子在特定环境中向外暴露的极性并不完全相同。

        分子内氢键、构象折叠以及环境依赖的构象重新分布，都可能改变极性基团与外部环境的接触程度，进而影响分子由水相进入脂质膜时的自由能代价。拓扑极性表面积（topological polar surface area，TPSA）、实验极性表面积（experimental polar surface area，EPSA）以及分子变色龙性，分别从不同层面帮助认识这一过程。

1. 高极性bRo5分子为何仍可能穿过细胞膜？

1.1 被动跨膜需要完成水相到脂质相的转移

对于主要依赖被动扩散进入细胞的药物分子，其跨膜过程可以简化为：

水相 → 膜水界面 → 脂质双层内部 → 另一侧水相

        在水相中，羟基、酰胺、胺、羰基等极性基团能够与周围水分子形成氢键和偶极相互作用。分子进入脂质双层内部后，周围环境由高极性水相转变为以烃链为主的低极性环境，原有的部分水合作用需要被破坏。

这一过程涉及脱溶剂化（desolvation）。

        对于具有较多暴露极性基团的分子，与水形成的有利相互作用通常较多。当分子由水相进入膜内部时，破坏这些相互作用所需的自由能代价可能相应增加，因此会提高被动跨膜过程中的能量成本。

        Rossi Sebastiano等对bRo5药物和临床候选物的研究表明，分子动态暴露的极性与被动通透性密切相关，而水溶性对具体三维构象的依赖相对较弱；构象变化所造成的极性暴露差异有助于解释部分高极性bRo5分子的跨膜行为[4]。

1.2 极性并不是决定膜通透性的单一因素

被动膜通透过程通常同时涉及：

①分子由水相进入脂质膜的能力；

②分子在膜内部的扩散；

③分子的尺寸和形状；

④脂溶性；

⑤离子化状态；

⑥分子的构象及其变化。

因此，高TPSA并不能直接推导出某个化合物一定具有低膜通透性。

对bRo5分子而言，更有分析价值的问题是：

分子进入低极性膜环境时，向外暴露的极性是否会因构象变化而降低。

        如果部分极性基团能够通过分子内作用得到屏蔽，分子由水相转入膜相时需要付出的脱溶剂化代价可能下降，由此增加被动跨膜的可能性。

2. TPSA与三维极性暴露之间存在什么差别？

2.1 TPSA提供二维结构的极性基准

TPSA根据二维分子结构中的极性原子及其连接环境计算，是药物化学中广泛使用的极性参数。

其优势明确：

①不需要获得分子的三维构象；

②计算速度快；

③易于在大量化合物之间比较；

④对早期药物性质分析具有较高实用价值。

但TPSA本身基本不随构象变化。

同一个分子从伸展构象转变为折叠构象时，原子组成和二维连接关系并没有发生变化，因此TPSA仍保持不变。

与此同时，极性基团在三维空间中的朝向以及与外部溶剂的接触程度，却可能明显改变。

2.2 相同TPSA可以对应不同的极性暴露状态

以同一个柔性bRo5分子为例，其不同构象可以表现出不同的三维特征：

        因此，TPSA反映的是分子二维拓扑结构中的潜在极性，而不能直接反映某一具体三维构象中极性基团的溶剂可接触程度。

        这种差异对于结构较小、构象变化有限的分子可能并不突出；对于尺寸较大、柔性较高的bRo5分子，构象变化对极性暴露的影响可能明显增加[4]。

3. 分子内氢键和构象折叠如何改变极性暴露？

3.1 分子内氢键可以屏蔽部分极性位点

        分子内氢键（intramolecular hydrogen bond，IMHB）是降低外部极性暴露的一种常见方式。

        当氢键供体（hydrogen-bond donor，HBD）与氢键受体（hydrogen-bond acceptor，HBA）分别暴露在水相中时，两者均可以与水形成氢键。

如果分子的空间构象使HBD和HBA处于适当的距离和取向，两者可能形成分子内氢键：

HBD···HBA

形成IMHB后，相关供体和受体与外部溶剂形成氢键的能力可能降低，使这部分极性在外部环境中的表现减弱。

        Goetz等利用超临界流体色谱并结合核磁共振实验研究了药物样分子的IMHB，结果显示，能够形成IMHB的结构可以表现出不同的实验极性特征，为高通量研究极性屏蔽提供了方法基础[2]。

        需要注意的是，二维结构中存在潜在的HBD和HBA几何关系，并不能证明IMHB在溶液中持续形成。IMHB的稳定程度还受到构象能量、原子间距离与取向、溶剂极性以及分子离子化状态等因素影响。

3.2 构象折叠可以减少溶剂可接触极性

对于较大的柔性分子，极性屏蔽通常不仅涉及单个IMHB，还可能伴随整个分子的三维折叠。

折叠过程中可能出现：

①极性基团转向分子内部；

②HBD与HBA形成分子内相互作用；

③疏水区域发生分子内接触；

④分子整体构象趋于紧凑；

⑤溶剂能够接触的极性区域减少。

        Rossi Sebastiano等研究发现，在一组bRo5化合物中，较低的溶剂可及三维极性与较高的被动通透性存在关联；动态IMHB、分子柔性以及芳香区域之间的分子内作用均可能参与调节这种极性暴露[4]。

由此可以形成一条连续的物理过程：

构象变化 → 极性基团空间排列改变 → 溶剂可接触极性改变 → 水合作用和膜分配发生变化 → 被动通透性受到影响

        不过，形成IMHB或紧凑构象并不意味着膜通透性一定提高。构象变化还可能同时影响溶解性、离子化状态、分子尺寸和膜内扩散，因此其最终效果仍需要结合实验数据判断。

        Atilaw等以一种VHL型PROTAC为研究对象，通过核磁共振实验结合构象分析发现，其三维构象具有明显的环境依赖性。在极性介质中，分子总体倾向于较伸展、较高极性暴露的构象；在用于模拟膜内部低极性环境的氯仿中，则更多形成紧凑的折叠构象。分子内氢键、酰胺基团屏蔽及其他分子内相互作用可共同降低溶剂可接触三维极性表面积和分子尺寸，为该化合物的分子变色龙行为提供结构依据。[Atilaw et al., 2021] [9]

        上图为不同极性环境下PROTAC 1的代表性构象及极性暴露变化。 原研究显示，PROTAC 1在极性环境中可呈现较伸展且极性暴露较高的构象，而在低极性环境中可形成更紧凑的折叠构象，并伴随分子内氢键形成及溶剂可接触三维极性表面积降低。图中展示的是该特定PROTAC的代表性研究结果，不代表所有bRo5分子均具有相同构象变化。图片引自Atilaw Y, et al. ACS Med Chem Lett. 2021;12:107-114，CC BY。[9]

4. 分子变色龙性源于环境依赖的构象集合变化

4.1 柔性bRo5分子通常以多个构象共同存在

柔性分子在溶液中通常不会长期保持单一三维结构，而是存在多个可以相互转化的构象。

这些构象共同构成构象集合（conformational ensemble）。

        不同构象具有不同自由能，因此在构象集合中的占比也不同。溶剂环境发生改变时，各种分子内和分子间相互作用随之改变，不同构象之间的相对稳定程度也会发生变化。

        在较高极性的环境中，暴露极性基团能够与溶剂形成有利相互作用，因此一些较开放的构象可能具有较高占比。

        在较低极性的环境中，外部环境对暴露极性基团的稳定作用减弱，能够形成IMHB、减少极性暴露或形成有利分子内接触的紧凑构象可能得到相对稳定。

这种变化表现为构象集合随环境重新分布。

        NMR结合NAMFIS分析进一步显示，PROTAC 1并不是在一个“开放态”和一个“折叠态”之间简单切换，而是在不同介质中形成组成和群体比例不同的构象集合。在CDCl₃中，主要构象整体较为折叠；在DMSO及DMSO/水体系中，则出现更多伸展构象。这一结果表明，环境改变的是不同构象的相对稳定性及其群体分布，而非产生单一、确定的构象转换。[Atilaw et al., 2021] [9]

        上图为PROTAC 1在不同极性介质中的主要溶液构象集合。 图中展示群体占比≥10%的主要构象。绿色为主要呈线性的构象，浅棕色为具有一个转折的折叠构象，灰色为具有两个转折的折叠构象；分子内氢键以黄色背景上的黑色虚线表示。构象集合由NMR实验数据结合NAMFIS分析获得。引自Atilaw Y, et al. ACS Med Chem Lett. 2021;12:107-114，CC BY。[9]

4.2 分子变色龙性不仅指“能够折叠”

        分子变色龙性（molecular chameleonicity）是指分子能够响应周围环境变化，通过调整构象集合而改变其对外表现出的理化性质。

Danelius等采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）研究宏环药物roxithromycin、telithromycin和spiramycin时发现，        这些分子在非极性环境中形成的构象集合总体上比在极性环境中更加紧凑，并表现出较低的极性暴露[5]。

        因此，以下三个概念需要加以区分：

        一个分子可以形成稳定的紧凑构象并表现出较低的极性暴露，但如果其构象和性质对环境变化并不敏感，则不能仅凭这一点判断其具有显著的分子变色龙性。

        2023年，Garcia Jimenez等开发了色谱参数Chamelogk，通过化合物在不同色谱条件下的行为变化，对这种环境响应特征进行实验表征，并将其应用于宏环、非宏环bRo5分子和PROTAC研究[6]。

5. EPSA为TPSA补充了哪些实验信息？

5.1 EPSA反映特定实验条件下的暴露极性

        Goetz等开发的EPSA方法基于超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）。化合物在色谱体系中的保留行为受到其与固定相和流动相相互作用的影响，因此可以用于表征分子对外呈现的极性特征[2,3]。

        EPSA虽然名称中包含“polar surface area”，但不是对某个分子三维几何表面积的直接测量。它属于实验性极性参数，能够对IMHB、构象屏蔽等引起的外显极性变化产生响应。

TPSA和EPSA因此提供了不同层面的信息：

EPSA并不替代TPSA。将两者结合分析，可以观察一个分子的二维极性与实验表现出的极性之间是否存在明显差异。

5.2 ETR用于比较EPSA与TPSA

        2024年，Price等分析了约1000个具有人体吸收数据的化合物，并研究了约10000个AbbVie工具化合物，其中包括约7000个Ro5化合物、约2000个bRo5化合物以及约1000个PROTAC[7]。

研究提出EPSA-to-TPSA ratio，即ETR：

ETR = EPSA / TPSA

ETR用于比较实验极性与二维拓扑极性之间的相对关系。

        在该研究建立的分析方法中，较低的ETR意味着EPSA相对于TPSA更低，提示该化合物具有较明显的极性降低（polarity reduction）特征[7]。

        TPSA是计算得到的拓扑参数，EPSA则来自色谱实验。ETR是基于两种参数建立的经验性比值，用于比较和识别具有特殊极性降低行为的化合物，而不是对分子真实几何表面积进行物理分割。

5.3 ETR与分子变色龙性不能直接等同

        较低ETR可以提示一个化合物的实验极性明显低于其拓扑极性，但单个ETR值并没有直接比较该分子在两个或多个环境中的构象集合。

而分子变色龙性所关注的是：

环境发生变化时，分子的构象分布和外显性质是否随之改变。

        因此，ETR适合用于发现具有明显极性降低特征的化合物；若研究目的进一步涉及环境依赖的构象变化，则可以结合不同溶剂条件下的NMR、构象计算以及Chamelogk等实验信息[5–7]。

TPSA、EPSA、ETR和分子变色龙性由此形成几个相互关联但并不等价的研究层次：

二维拓扑极性 → 三维极性屏蔽 → 实验外显极性 → 环境依赖的构象变化

6. 这些性质如何影响bRo5药物设计？

6.1 从减少极性基团转向调节极性暴露

改善膜通透性的一种传统结构优化方式，是减少氢键供体、受体或其他极性官能团，从而降低TPSA。

但药物分子中的极性基团往往承担明确功能，例如：

①与靶蛋白形成关键氢键；

②维持结合选择性；

③调节水溶性；

④影响离子化状态。

直接删除这些基团可能改善通透性，同时也可能降低靶点结合能力或改变其他药代性质。

对于部分bRo5化合物，可以进一步考察另一种设计方式：

保留与药理活性相关的必要极性，同时通过三维构象降低非必要的外部极性暴露。

这也是动态极性研究对药物化学设计的重要意义。

6.2 结构修改需要关注构象和极性的联动变化

以下结构变化均可能影响bRo5分子的构象及极性暴露：

        这些结构变化并不存在统一的优化方向。

        例如，N-甲基化在某些环肽中可以改善通透性，而修饰位置不同，效果也可能明显不同。Goetz等的EPSA研究正显示出，不同位置的N-甲基化可以产生不同的极性和通透性结果[3]。

        同样，增加构象刚性可能稳定有利的低暴露极性构象，也可能限制分子进入其他必要构象。因此，评价某项结构修改时，需要观察该修改实际上改变了怎样的构象集合和实验性质。

6.3 从结构参数到通透实验需要形成连续证据

研究bRo5系列时，可以将不同层次的数据放在同一结构—性质关系中分析：

二维结构、TPSA和离子化性质

↓

构象分析与IMHB形成情况

↓

EPSA和ETR

↓

被动通透性或Caco-2细胞单层通透实验

↓

外排转运情况

↓

溶解性和体内吸收

这种分析方式可以帮助区分不同来源的问题。

        例如，一个化合物TPSA较高，但EPSA和通透性均较好，可能提示存在有效的极性屏蔽；如果EPSA较低但细胞通透仍然较差，则还需要进一步检查分子尺寸、离子化或外排转运等因素。

        EPSA和ETR的价值因此主要体现在连接化学结构、三维构象和实验通透性之间的关系，而不是代替实际的ADME实验。

7. 从膜通透到口服吸收：还需要考虑哪些因素

被动膜通透性只是药物从胃肠道进入体循环过程中的一个环节。

口服吸收还可能受到以下因素影响：

①药物的溶解和溶出；

②胃肠道中的离子化状态；

③被动膜通透；

④摄取和外排转运；

⑤肠壁代谢。

进入门静脉后，系统暴露还会受到肝脏首过代谢等过程影响。

因此，具有明显极性屏蔽或分子变色龙性的化合物，并不一定具有良好的口服吸收。

这一点在PROTAC研究中尤为值得注意。

        2026年，Le Manach等使用AstraZeneca的一组PROTAC系统评估已有的口服设计指标。研究没有观察到预测或实验性分子变色龙参数能够稳定区分其数据集中的口服吸收表现；相较之下，降低人结直肠腺癌Caco-2细胞单层模型中的外排比（efflux ratio），对该数据集的设计判断提供了更有用的信息[8]。

        这项研究说明，分子变色龙性有助于解释bRo5分子的三维极性和跨膜行为，但从跨膜通透进一步推导到口服吸收，需要同时考虑转运、溶解和代谢等其他过程。

        对bRo5分子而言，TPSA仍然是重要的二维极性参数，但当分子具有较高构象自由度时，三维极性暴露及其环境依赖变化也需要纳入分析。EPSA、ETR以及分子变色龙性相关研究，为理解这类分子的构象、极性与膜通透之间的关系提供了补充信息。在实际药物设计中，这些参数仍需与溶解性、离子化、细胞通透、外排转运及体内药代数据结合使用。

8. bRo5分子被动跨膜通透机制相关代表化学品：分类、产品信息与科研应用

表1. 大环与分子变色龙性研究相关化合物

表2. 靶向蛋白降解分子构建相关化合物

表3. N-甲基氨基酸与肽类构象调控构件

注：以上为阿拉丁代表性科研相关产品，具体用途应结合产品规格、批次COA及目标反应或评价体系确定。更多产品规格、级别和COA信息可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。

参考文献

[1] Lipinski CA, Lombardo F, Dominy BW, Feeney PJ. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev. 2001;46(1–3):3–26. doi:10.1016/S0169-409X(00)00129-0.

[2] Goetz GH, Farrell W, Shalaeva M, Sciabola S, Anderson D, Yan J, Philippe L, Shapiro MJ. High Throughput Method for the Indirect Detection of Intramolecular Hydrogen Bonding. J Med Chem. 2014;57(7):2920–2929. doi:10.1021/jm401859b.

[3] Goetz GH, Philippe L, Shapiro MJ. EPSA: A Novel Supercritical Fluid Chromatography Technique Enabling the Design of Permeable Cyclic Peptides. ACS Med Chem Lett. 2014;5(10):1167–1172. doi:10.1021/ml500239m.

[4] Rossi Sebastiano M, Doak BC, Backlund M, Poongavanam V, Over B, Ermondi G, Caron G, Matsson P, Kihlberg J. Impact of Dynamically Exposed Polarity on Permeability and Solubility of Chameleonic Drugs Beyond the Rule of 5. J Med Chem. 2018;61(9):4189–4202. doi:10.1021/acs.jmedchem.8b00347.

[5] Danelius E, Poongavanam V, Peintner S, Wieske LHE, Erdélyi M, Kihlberg J. Solution Conformations Explain the Chameleonic Behaviour of Macrocyclic Drugs. Chem Eur J. 2020;26(23):5231–5244. doi:10.1002/chem.201905599.

[6] Garcia Jimenez D, Vallaro M, Rossi Sebastiano M, Apprato G, D’Agostini G, Rossetti P, Ermondi G, Caron G. Chamelogk: A Chromatographic Chameleonicity Quantifier to Design Orally Bioavailable Beyond-Rule-of-5 Drugs. J Med Chem. 2023;66(15):10681–10693. doi:10.1021/acs.jmedchem.3c00823.

[7] Price E, Weinheimer M, Rivkin A, Jenkins G, Nijsen M, Cox PB, DeGoey D. Beyond Rule of Five and PROTACs in Modern Drug Discovery: Polarity Reducers, Chameleonicity, and the Evolving Physicochemical Landscape. J Med Chem. 2024;67(7):5683–5698. doi:10.1021/acs.jmedchem.3c02332.

[8] Le Manach C, Viklund J, Kwapień K, Winiwarter S. Evaluation of Oral PROTAC Guidelines: Efflux Ratio Outweighs Chameleonicity Descriptors. ACS Med Chem Lett. 2026;17(4):890–899. doi:10.1021/acsmedchemlett.6c00043.

[9] Atilaw Y, Poongavanam V, Svensson Nilsson C, Nguyen D, Giese A, Meibom D, Erdélyi M, Kihlberg J. Solution Conformations Shed Light on PROTAC Cell Permeability. ACS Med Chem Lett. 2021;12(1):107–114. doi:10.1021/acsmedchemlett.0c00556.

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