IHC中的清洗步骤直接影响两类结果：一类是未结合或弱结合检测试剂能否被充分移除；另一类是已经形成的特异性结合能否稳定保留。PBS、TBS、PBST及TBST的差别不只在名称，而在于缓冲骨架、表面活性剂状态及其对应的实验边界。方法优化时，先判断基础缓冲体系，再决定是否加入Tween-20，通常比单纯增加洗涤次数更有效。

        关键词：IHC；PBS；TBS；PBST；TBST；Tween-20；HRP-DAB；AP显色；清洗体系

1 清洗体系在IHC中的作用定位

1.1 游离试剂去除

        清洗的第一任务是去除游离状态和弱吸附状态的一抗、二抗、聚合物放大试剂及其他检测试剂。若这一环节不足，阴性区域容易出现弥散性浅染，切片边缘、组织裂隙、腔隙周围和间质区更容易出现局部残留。

1.2 已结合复合物保留

        清洗液不仅影响未结合试剂的去除，也影响已形成抗原-抗体复合物的保留。对低丰度抗原、弱亲和力抗体、膜表面标志物及细胞边界型定位信号，洗涤过强更容易导致信号变浅、阳性细胞数量减少或边界模糊。

1.3 显色前环境控制

        不同检测体系对缓冲成分的容忍度并不一致。清洗液会直接进入后续显色前环境，因此基础缓冲骨架选错时，后续再延长清洗时间，往往也难以弥补体系兼容性上的偏差。

1.4 背景形态的判断价值

（1）阴性区弥散浅染，多见于试剂残留偏高。

（2）边缘、裂隙、腔隙周围着色偏深，多见于润湿不足或局部残液。

（3）坏死区、血液成分丰富区域沉积偏多，多见于组织滞留和放大背景。

（4）全片本底普遍偏深，则需同时回看封闭、内源性酶处理和显色时间。

2 PBS与TBS的基础差异

2.1 PBS的适用范围

        PBS更适合常规HRP-DAB型IHC流程。多数石蜡切片项目只要抗体和检测试剂已在PBS条件下建立稳定流程，PBS即可作为起始方案。

（1）HRP或HRP聚合物检测体系。

（2）既有方法已在PBS条件下获得稳定对照。

（3）封闭液、抗体稀释液与清洗液均采用PBS骨架。

（4）当前主要问题是一般性背景控制，而非显色体系兼容性。

2.2 TBS的适用范围

        TBS优先用于AP显色流程。只要检测体系包含碱性磷酸酶，清洗液通常就不宜继续使用PBS。对这类流程，TBS属于基础条件。

（1）AP显色检测。

（2）抗体说明书或验证条件明确为Tris体系。

（3）封闭液、抗体稀释液、放大体系已采用Tris骨架。

（4）同类项目已有TBS流程基础，需要保持批次一致性。

2.3 PBS与TBS的切换判断

（1）检测体系是否要求Tris骨架。

（2）说明书或既有方法是否已有明确体系。

（3）当前问题是否来自体系兼容性，而不是抗体浓度、封闭条件或显色时间。

表1 PBS与TBS的选择判断

3 PBST与TBST的强化清洗逻辑

3.1 Tween-20加入后的变化

        PBST和TBST是在PBS或TBS基础上加入Tween-20形成的含表面活性剂清洗体系。加入Tween-20后，切片表面的液体铺展能力、组织润湿程度和疏水性残留的洗脱效率都会提升。

        常见变化包括：

（1）切片表面覆盖更均匀。

（2）二抗、聚合物放大试剂和蛋白性残留更容易被洗掉。

（3）边缘、裂隙和腔隙处的局部沉积更容易下降。

3.2 适合加入Tween-20的情形

        含Tween-20体系更适合处理“残留偏高”这一类问题，常见于：

（1）二抗后阴性区域不够干净。

（2）聚合物放大后空白区出现浅度沉积。

（3）切片边缘或组织裂隙处显色不均。

（4）坏死成分、血液成分、黏液样基质较多的组织。

（5）阴性对照也可见残留型背景。

3.3 不宜优先加入Tween-20的情形

        以下情况更适合先用PBS或TBS评估，不宜起始即改为PBST或TBST：

（1）抗原表达弱，阳性接近检测阈值。

（2）一抗亲和力一般，复合物不够牢固。

（3）膜蛋白、细胞表面标记或精细定位标志物。

（4）冷冻切片、脆弱组织或附着力不足切片。

（5）前处理已经偏强，继续强化清洗更容易导致信号下滑。

4 四种清洗体系的实验定位

4.1 功能分工

        PBS主要用于常规HRP-IHC基础清洗。TBS主要用于AP流程及Tris骨架流程。PBST用于在PBS基础上处理残留偏高和润湿不足。TBST用于在TBS基础上进一步增强去残留能力。

4.2 按实验问题选择体系

        遇到不同问题时，四种体系的优先级并不相同。

（1）流程为HRP-DAB，先从PBS起步。

（2）流程为AP显色，先从TBS起步。

（3）基础体系已确定但残留明显，再考虑PBST或TBST。

（4）主要问题是弱阳性或细定位信号不稳，先保留PBS或TBS，不急于加入Tween-20。

表2 PBS、TBS、PBST及TBST的定位比较

5 面向IHC流程的选择策略

5.1 先定基础缓冲骨架

（1）先看检测体系。

（2）再看说明书或既有流程。

（3）最后才是当前背景表现。

        只要是AP流程，优先评估TBS；只要是常规HRP-DAB流程，优先评估PBS。不要在基础骨架尚未确定时同时切换PBS/TBS并加入Tween-20。

5.2 再定是否需要Tween-20

（1）阴性区弥散浅染，优先考虑含Tween-20体系。

（2）边缘浓集、裂隙残留，优先考虑含Tween-20体系。

（3）坏死区、血液区沉积，含Tween-20体系通常更有效。

（4）弱阳性减少、边界变浅，则先回退到不含Tween-20体系。

5.3 局部强化优于全程强化

（1）一抗后背景高，先强化一抗后清洗。

（2）二抗后背景高，重点强化二抗后清洗。

（3）放大后沉积明显，强化放大后至显色前的清洗。

6 实验中的推荐决策路径

6.1 常规HRP-DAB石蜡IHC

（1）先以PBS建立基础流程。

（2）观察二抗后和显色前的背景。

（3）若背景集中为残留型浅染，可将关键步骤改为PBST。

（4）若PBST后阳性明显变浅，则回到PBS，并检查封闭、一抗浓度及显色时间。

6.2 AP显色IHC

（1）先用TBS跑通完整流程。

（2）确认阳性存在且定位合理。

（3）若阴性区仍有明显残留背景，再局部评估TBST。

（4）若TBST后信号变浅，优先缩短强化清洗步骤，而不是继续增加洗涤强度。

6.3 低丰度抗原与弱阳性标志物

（1）先用PBS或TBS，不加Tween-20。

（2）洗涤时间保持温和，避免强振荡。

（3）重点比较阳性细胞数、定位边界和阴性区背景。

（4）若信号偏弱，先回看抗原修复、一抗浓度和孵育时间，不先强化清洗。

6.4 高背景复杂样本

        对肿瘤组织、炎症组织、坏死明显样本、富血液成分样本或黏液样组织，可按以下路径处理：

（1）先确定基础骨架是PBS还是TBS。

（2）再在关键步骤引入PBST或TBST。

（3）重点强化二抗后和放大后清洗。

（4）若阴性对照仍高，回看封闭、抗体特异性和前处理，而不是只在清洗液上反复调整。

表3 常见场景下的清洗体系选择

7 清洗体系优化中的常见误区

7.1 将所有背景都归因于清洗不足

        若背景来源于封闭不足、内源性酶处理不充分、抗体浓度过高或显色时间过长，仅更换PBS、TBS、PBST或TBST通常不能根本解决问题。背景来源先要分清，再决定是否调整清洗体系。

7.2 将含Tween-20体系作为默认配置

        PBST和TBST对去残留有效，但对弱信号项目未必有利。凡是低丰度抗原、边界性阳性或精细定位项目，都应先判断信号损失风险，再决定是否加入Tween-20。

7.3 一次同时更换多个变量

        若同时更换基础缓冲骨架、是否加Tween-20、洗涤时间和振荡强度，结果往往难以解释。更稳妥的顺序是：

（1）先定PBS还是TBS。

（2）再定是否加入Tween-20。

（3）最后微调洗涤时间和次数。

7.4 只比较颜色深浅

        清洗体系的优劣不只看染色深浅，还要看：

（1）阳性定位是否符合组织学预期。

（2）阴性区域是否干净。

（3）细胞边界是否清晰。

（4）坏死区、血管周围和基质区是否出现异常沉积。

（5）同批次切片之间是否具有重复性。

8 IHC清洗体系相关产品

8.1 缓冲体系基础组分产品表

8.2 即用型与预混清洗液产品表

        PBS、TBS、PBST和TBST没有脱离实验条件的固定优先级。HRP-DAB流程先评估PBS，AP流程先评估TBS；残留型背景明显时，再考虑PBST或TBST；弱阳性和精细定位项目，则先控制清洗强度，再决定是否引入Tween-20。按这一顺序调整，路径更清晰，结果也更容易复现。

更多相关文章，详见下方：

[1] IHC常见问题分析及处理

[2] 免疫组化（荧光）实验

[3] 石蜡切片免疫组化实验步骤