1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于规范组织预处理、固定、蔗糖保护、OCT包埋、快速冷冻、低温切片、切片收集、冻存及复温操作，适用于动物组织及科研组织样本的免疫荧光、免疫组织化学、酶组织化学、脂质染色和常规组织形态学研究。

1.2 方法原理

        组织快速冷冻后，组织内水分凝固，使组织获得适宜的切割硬度，可在低温恒温切片机中切割为5～20 μm厚的切片。OCT冷冻切片包埋剂能够固定组织方向、填充组织周围空隙，并在低温下为组织提供机械支撑。

        固定后的组织经蔗糖溶液充分渗透，可减少组织内自由水含量，降低冷冻过程中大冰晶形成造成的细胞和组织结构损伤。完成切片后，可将组织切片直接贴附于载玻片，也可收集至冰冻切片冻存液中，于-20℃保存，待后续实验时复温并漂洗。

2 材料与试剂

2.1 组织样本

（1）新鲜动物组织。

（2）灌流固定后的动物组织。

（3）手术切除或活检组织。

        组织取材后应尽快处理，避免组织干燥、自溶或长时间暴露于室温环境。

2.2 主要试剂

（1）PBS，pH 7.4。

（2）4%多聚甲醛固定液。

（3）15%蔗糖溶液。

（4）30%蔗糖溶液。

（5）OCT冷冻切片包埋剂。

（6）冰冻切片冻存液。

（7）液氮。

（8）异戊烷。

（9）组织学级丙酮。

（10）甲醇。

2.3 主要耗材

（1）组织包埋盒。

（2）低温恒温切片机样品托。

（3）一次性切片刀片。

（4）防脱载玻片、正电荷载玻片或明胶包被载玻片。

（5）24孔板或48孔板。

（6）毛笔或切片刷。

（7）镊子。

（8）吸水纸。

（9）样本冻存盒。

2.4 主要设备

（1）低温恒温切片机。

（2）-80℃冰箱。

（3）-20℃冰箱。

（4）4℃冰箱。

（5）水平摇床。

（6）液氮罐。

（7）通风橱。

3 试剂配制

3.1 15%蔗糖溶液

        称取15 g蔗糖，加入约80 mL PBS，充分溶解后以PBS定容至100 mL。过滤除菌后置于4℃保存。

3.2 30%蔗糖溶液

        称取30 g蔗糖，加入约70 mL PBS，充分溶解后以PBS定容至100 mL。过滤除菌后置于4℃保存。

        蔗糖溶液应保持澄清。出现浑浊、沉淀或微生物污染时不得继续使用。

4 组织预处理

4.1 组织取材与修整

（1）组织取材后立即置于预冷PBS中。

（2）使用PBS轻柔清洗组织表面，去除血液及其他残留物。

（3）去除无关脂肪、结缔组织和坏死组织。

（4）将组织修整为适合包埋的大小，组织厚度一般不宜超过5～10 mm。

（5）明确拟观察切面，并记录组织方向。

        组织块过大时，中心区域固定、蔗糖渗透和冷冻速度较慢，容易出现固定不均、冰晶形成或组织硬度不一致。

4.2 固定后冷冻处理

（1）组织固定

        将修整后的组织完全浸没于4%多聚甲醛固定液中，于4℃摇床上固定2～4 h。

        固定时间应根据组织类型和组织块大小调整。较大或结构致密的组织可适当延长固定时间，但一般不建议超过24 h，以免组织过度交联并影响抗原识别。

（2）组织清洗

        固定完成后，使用预冷PBS清洗组织3次，每次5～10 min。

（3）蔗糖保护

        将组织置于15%蔗糖溶液中，于4℃处理至组织基本下沉。

        组织基本下沉后转入30%蔗糖溶液中，于4℃继续处理至组织完全下沉。

        组织是否完成蔗糖保护应以组织下沉情况为主要判断依据，不宜仅按固定时间结束处理。

4.3 新鲜组织直接冷冻处理

（1）使用预冷PBS快速清洗组织表面。

（2）使用吸水纸轻轻吸除组织表面多余液体。

（3）不得挤压组织或使组织长时间暴露于室温。

（4）立即进行OCT包埋和快速冷冻。

        新鲜组织直接冷冻后，可根据后续检测要求选择4%多聚甲醛、冷丙酮或冷甲醇进行切片后固定。

5 OCT包埋与组织速冻

5.1 组织包埋

（1）在组织包埋盒上标记样本编号、组织类型和拟观察切面。

（2）向包埋盒底部加入少量预冷OCT冷冻切片包埋剂。

（3）使用镊子将组织放入OCT中，使拟观察切面朝向包埋盒底部。

（4）调整组织位置和方向，使组织保持平整。

（5）继续加入OCT，直至组织被完全覆盖。

（6）检查组织周围是否存在明显气泡，必要时使用针头或镊子轻轻排除。

5.2 异戊烷预冷

（1）将适量异戊烷加入耐低温容器中。

（2）将装有异戊烷的容器置于液氮中进行外部冷却。

（3）待异戊烷充分降温并开始出现轻微黏稠或边缘结晶时使用。

（4）不得使异戊烷完全凝固。

5.3 组织速冻

（1）将盛有组织和OCT的包埋盒放入预冷异戊烷中。

（2）保持包埋盒平稳，避免组织位置发生改变。

（3）待OCT完全变白并凝固后立即取出。

（4）将冻结后的组织包埋块转移至干冰或预冷冻存盒中。

（5）不得使冻结后的包埋块在室温下长时间停留。

        不建议将未密封的组织包埋块直接浸入液氮，以免液氮剧烈沸腾导致OCT开裂、组织移位或冷冻不均。

5.4 组织包埋块保存

（1）确认组织包埋块已完全冻结。

（2）将组织包埋块密封包装。

（3）标记样本名称、组织类型、处理方式和冻存日期。

（4）置于-80℃保存。

（5）避免组织包埋块反复冻融。

6 冰冻切片

6.1 低温恒温切片机预冷

（1）提前开启低温恒温切片机。

（2）将切片室温度初步设定为-18～-22℃。

（3）待切片室、刀架、样品头和速冻架充分预冷后开始操作。

（4）清洁样品台、刀架、防卷板及切片室。

        脂肪含量较高的组织通常需要适当降低切片温度；含水量较高或质地较脆的组织可适当提高切片温度。

6.2 样品托准备

（1）在预冷样品托表面加入约2～3 mm厚的OCT。

（2）将样品托置于切片机速冻架上，使OCT初步凝固。

（3）从-80℃取出组织包埋块并去除包埋盒。

（4）将组织包埋块按照预定切面方向放置于样品托OCT表面。

（5）在组织包埋块周围补加少量OCT进行固定。

（6）待OCT完全凝固后，将样品托安装至样品头。

6.3 组织温度平衡

        将安装好的组织包埋块置于低温恒温切片机内平衡20～30 min，使组织包埋块与切片室温度接近。

        组织温度过低时，切片容易卷曲、破裂或出现刀痕；组织温度过高时，切片容易变形、粘刀或无法保持完整形态。

6.4 刀片安装

（1）锁定低温恒温切片机手轮。

（2）将一次性切片刀片安装至刀架并锁紧。

（3）刀片间隙角可初步设定为5°～7°。

（4）调整防卷板，使其靠近刀刃但不与刀刃直接接触。

（5）确认刀架、样品托和样品头均已固定牢固。

6.5 组织修片

（1）将切片厚度设定为20～50 μm。

（2）缓慢推进组织包埋块进行粗修。

（3）持续修片，直至完整组织切面暴露。

（4）观察组织内部是否存在裂隙、空洞、明显冰晶或未完全冻结区域。

（5）必要时调整组织方向或切片温度。

（6）完整切面形成后，将切片厚度调整至正式切片厚度。

6.6 正式切片

        根据后续实验选择适宜的切片厚度：

（1）常规免疫荧光：5～10 μm。

（2）一般组织形态学观察：8～12 μm。

（3）较厚组织结构观察或自由漂浮切片：10～20 μm。

        以稳定、均匀的速度转动手轮。切片发生卷曲时，可使用毛笔或切片刷轻轻引导切片前缘，使切片在刀架或防卷板表面平整展开。

7 切片收集与保存

7.1 载玻片贴附法

（1）将防脱载玻片靠近展开的组织切片。

（2）利用载玻片与低温切片之间的温差，使切片自然吸附于载玻片表面。

（3）也可使用毛笔将展开的切片轻轻转移至载玻片。

（4）避免毛笔反复摩擦组织区域。

（5）同一载玻片上的多个组织切片应保持适当间距。

（6）在载玻片边缘标记样本编号和切片顺序。

（7）将载玻片水平放置，于室温复温并干燥20～30 min。

（8）短期内进行实验的切片可直接固定或染色。

（9）长期保存时，将完全干燥的切片密封后置于-80℃。

7.2 冰冻切片冻存

（1）根据切片数量准备24孔板或48孔板。

（2）向每孔加入1～2 mL冰冻切片冻存液。

（3）使用预冷毛笔或切片刷将组织切片轻柔转移至孔板中。

（4）确认切片完全浸没于冻存液中，不得折叠或粘附于孔壁。

（5）按照样本编号和切片顺序依次收集切片。

（6）封闭孔板并标记样本信息、切片序号和冻存日期。

（7）将孔板置于-20℃保存。

8 冻存切片复温与漂洗

8.1 切片复温

（1）实验前从-20℃取出装有切片的孔板。

（2）将孔板置于室温约10 min。

（3）待冻存液恢复流动状态后进行后续操作。

（4）不得使用高温水浴或加热板加速复温。

8.2 去除冻存液

（1）确认切片位置后，沿远离切片的一侧缓慢吸除冻存液。

（2）加入4℃预冷PBS，使切片完全浸没。

（3）置于摇床上轻柔漂洗10 min。

（4）吸除PBS后，加入室温PBS漂洗2次，每次5 min。

（5）漂洗完成后进行固定、封闭、透化、抗体孵育或组织学染色。

        切片在复温、吸液和漂洗过程中应始终保持湿润。

9 切片后固定

9.1 4%多聚甲醛固定

（1）使用PBS清洗切片。

（2）加入4%多聚甲醛固定液，使其完全覆盖切片。

（3）室温固定10～15 min。

（4）固定后使用PBS清洗3次，每次5 min。

        该方法适用于多数常规免疫荧光和组织形态学实验。

9.2 冷丙酮固定

（1）将组织学级丙酮预冷至-20℃。

（2）将切片完全浸入冷丙酮中。

（3）于-20℃固定10 min。

（4）取出切片后在通风橱内短暂晾干。

（5）使用PBS清洗3次，每次5 min。

9.3 冷甲醇固定

（1）将甲醇预冷至-20℃。

（2）将切片完全浸入冷甲醇中。

（3）于-20℃固定5～10 min。

（4）取出后使用PBS清洗3次，每次5 min。

        冷丙酮和冷甲醇固定条件应根据目标抗原及后续染色方法进行预实验确认。

10 常见问题与原因分析

10.1 切片卷曲

（1）组织包埋块温度过低。

（2）防卷板位置不合适。

（3）切片速度过快。

（4）刀片间隙角不合适。

        可适当提高切片温度，并重新调整防卷板位置和刀片角度。

10.2 切片粘刀

（1）组织包埋块温度过高。

（2）组织或OCT未充分冻结。

（3）刀片表面存在水分或污染。

（4）切片室温度波动较大。

        可适当降低切片温度，延长组织温度平衡时间，并清洁或更换刀片。

10.3 切片破碎或出现裂纹

（1）组织温度过低。

（2）组织固定过度。

（3）蔗糖保护不足。

（4）组织冷冻速度过慢。

（5）刀片钝化或存在缺口。

（6）切片速度不稳定。

10.4 组织出现蜂窝状空泡

（1）组织冷冻速度过慢。

（2）组织块体积过大。

（3）固定组织未充分进行蔗糖保护。

（4）组织内形成较大冰晶。

10.5 切片厚薄不均

（1）样品托、刀架或样品头未锁紧。

（2）组织切面与刀片不平行。

（3）切片机存在机械振动。

（4）组织包埋块硬度不均。

（5）手轮转动速度不稳定。

10.6 组织从载玻片脱落

（1）使用普通未处理载玻片。

（2）切片未充分贴附和干燥。

（3）组织固定不足。

（4）后续清洗力度过大。

（5）组织切片过厚。

10.7 冻存切片折叠或粘壁

（1）切片未充分展开。

（2）毛笔直接挤压切片。

（3）冻存液体积不足。

（4）切片未完全浸没。

        应在切片平整展开后轻柔转移，并保证冻存液完全覆盖切片。

10.8 后续染色背景较高

（1）冻存液未充分漂洗。

（2）切片复温后直接进行抗体孵育。

（3）PBS漂洗时间不足。

（4）切片在操作过程中发生干燥。

        应按规定使用预冷PBS和室温PBS充分漂洗后，再进行封闭、透化或抗体孵育。

11 安全与废弃物处理

（1）操作液氮和低温样本时，应佩戴防冻手套和护目镜。

（2）不得将密闭容器直接置于液氮中。

（3）异戊烷高度易燃，应远离火源，并在通风良好的区域操作。

（4）丙酮和甲醇易燃且具有挥发性，应在通风橱内操作。

（5）多聚甲醛具有刺激性和潜在毒性，应在通风橱内操作。

（6）安装、调整和拆卸切片刀片前，应锁定切片机手轮并使用刀片护具。

（7）废弃刀片应放入专用锐器盒。

（8）组织废物、固定液、冻存液和有机溶剂废液应分类收集，并按照实验室生物安全及化学废物管理要求处理。

12 冰冻组织切片制备及冻存相关产品

更多相关文章，详见下方：

[1] 冰冻切片免疫荧光

[2] 冰冻切片固定实验

[3] 冰冻切片的原位杂交实验

[4] 冰冻切片淀粉样蛋白（AMYLOID）硫磺素T（thioflavine T）荧光染色