1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于SYTO 9与PI联合活死染色在微生物活性评价中的标准化应用，适用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等悬浮菌样本，也可扩展至生物膜样本、复杂基质样本以及酵母/真菌样本的膜完整性分层分析。该方法适合抗菌评价、消毒处理比较、材料抗菌研究以及环境或食品样本的快速状态筛查，但不宜单独替代培养法、代谢法或增殖法完成绝对存活判定。

1.2 原理简介

（1）SYTO 9能够进入膜完整细胞，也可进入部分膜受损细胞，因此更接近“总体细胞核酸信号”或“膜完整群背景”标记，而不是绝对意义上的活细胞专属染料。

（2）PI主要在膜通透性升高或膜结构破坏后进入细胞并与核酸结合，因此更适合作为膜受损群指示，而不是简单等同于不可逆死亡。

（3）联合染色时，SYTO 9和PI都会与核酸结合。PI进入受损细胞后，通常会削弱或置换SYTO 9在局部核酸上的信号优势，因此膜受损细胞往往表现为红色主导。绿色主导更接近膜完整群，红色主导更接近膜受损群，红绿混合更常提示过渡损伤群或异质性群体。

2 材料与试剂

2.1 核心染料

（1）SYTO 9染料组分A。

（2）PI染料组分B。

2.2 基础试剂

（1）营养肉汤培养基。

（2）0.85% NaCl溶液或适当缓冲液。

（3）70%异丙醇，用于死菌对照制备。

（4）无菌dH2O。

（5）可选：BSA，用于降低低浓度样本非特异吸附。

2.3 仪器与耗材

（1）台式离心机，可达到10000×g。

（2）荧光显微镜。

（3）荧光度计。

（4）荧光酶标仪。

（5）玻璃或丙烯酸酯比色皿（1 cm光程）。

（6）16×125 mm高硼硅玻璃培养管。

（7）平底96孔板。

（8）微量离心管、30–40 ml离心管、载玻片及18 mm方形盖玻片。

3 标准活菌/死菌对照样本制备

3.1 菌液培养

（1）用营养肉汤培养大肠杆菌或金黄色葡萄球菌30 ml，使其生长至对数生长期后期。

（2）于10000×g离心10–15 min，浓缩25 ml细菌培养物。

（3）吸去上清液，用2 ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬沉淀。

3.2 活菌与死菌对照制备

（1）取1 ml重悬菌液，分别加入含20 ml 0.85% NaCl或适当缓冲液的30–40 ml离心管，作为活菌对照。

（2）另取1 ml重悬菌液，加入含20 ml 70%异丙醇的30–40 ml离心管，作为死菌对照。

（3）两管样品于室温孵育1 h，每隔15 min颠倒混匀一次。

（4）两管样品于10000×g离心10–15 min。

（5）用20 ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬沉淀，并按上述条件再离心一次，以去除残余异丙醇。

（6）分别用10 ml 0.85% NaCl或适当缓冲液重悬两管样品。

3.3 浓度标准化

（1）分别取3 ml菌液测定670 nm光密度（OD670），可使用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1 cm光程）。

（2）进入染色前，活菌组、死菌组及其混合组应统一调整至相同菌体浓度或相近OD水平，以避免总菌量差异干扰后续红/绿信号比较。

（3）若需建立方法学校准曲线，可进一步配制不同活/死比例混合样本。该步骤在新菌种建系、仪器初次优化或新批次染料验证时尤其有价值。

4 染色体系与对照设置

4.1 对照设置

        每批实验至少建议设置以下5类对照：

（1）空白基质对照，用于识别自发荧光和颗粒背景。

（2）SYTO 9单染对照，用于判断绿色背景和串色。

（3）PI单染对照，用于判断红色背景和串色。

（4）活菌双染对照，用于建立绿色主导区。

（5）死菌双染对照，用于建立红色主导区。

        对于复杂样本，这些对照不建议省略；其中单染对照和空白对照对阈值设定、串色判断及颗粒干扰识别尤为关键。

4.2 染色共性要求

（1）SYTO 9与PI应按固定比例配制，实验中不宜为了追求某一通道更亮而随意改变配比。配比变化会直接影响联合染色后的信号主导关系。

（2）染色过程应避光进行。

（3）室温避光孵育15 min可作为默认起始条件；若目标菌种、样本密度或检测平台发生变化，应通过预实验优化。孵育过短可能低估膜受损群，孵育过长则可能增加背景、扩散和信号漂移。

（4）染色后应尽量在固定时间窗口内完成检测，避免不同样本间停留时间差异导致批间波动。

5 实验流程A：荧光显微镜检测

5.1 适用场景

        适用于悬浮菌、生物膜、附着样本及局部损伤模式分析。显微检测更适合观察形态、聚集状态、空间分布及表层/深层异质性。

5.2 操作步骤

（1）在微量离心管内组合等量的组分A（SYTO 9）和组分B（PI），混匀。

（2）每1 ml细菌悬液中加入3 µl染料预混液。按该推荐稀释条件，最终染色工作液中DMSO含量约为0.3%。

（3）轻轻混匀后，室温避光孵育15 min。

（4）吸取5 µl染色后的细菌悬液至载玻片上，覆盖18 mm方形盖玻片。

（5）使用适合绿色通道、红色通道及双通道观察的滤光片组合进行观察；若需分别观察，可分开采集绿色和红色通道。

（6）组间应固定曝光时间、增益和采集参数。对于生物膜或附着样本，应记录多个视野或不同层位，而不是仅取单一代表区域。

6 实验流程B：荧光度计检测

6.1 适用场景

        适用于建立绿/红荧光比值与活菌比例之间的对应关系，用于批量比较处理前后膜完整性变化。

6.2 样本浓度调整

（1）大肠杆菌悬液（活菌和死菌）调整至1×10^8个细菌/ml，约对应0.03 OD670。

（2）金黄色葡萄球菌悬液（活菌和死菌）调整至1×10^7个细菌/ml，约对应0.15 OD670。

（3）用于荧光度计检测时，金黄色葡萄球菌悬液浓度通常比大肠杆菌低10倍。

6.3 活/死比例样本配制

        在1 cm玻璃、丙烯酸酯或石英荧光比色皿中配制5组不同活/死比例的细菌悬液，每个样本总体积为3 ml。

6.4 染色步骤

（1）在微量离心管内分别加入30 µl组分A（SYTO 9）和30 µl组分B（PI），混匀形成染料预混液。

（2）向每组不同活/死比例的细菌悬液中加入9 µl染料预混液。

（3）用枪轻轻吹打数次混匀，室温避光孵育15 min。

6.5 荧光测定与数据分析

（1）用荧光度计测定每组细菌悬液的荧光发射光谱，激发波长470 nm，发射扫描范围490–700 nm。

（2）分别积分510–540 nm区间的绿色荧光和620–650 nm区间的红色荧光。

（3）计算绿/红荧光比值：RatioG/R = Fcell,em1 / Fcell,em2。

（4）以活菌比例为横坐标，以RatioG/R为纵坐标绘图，用于建立参考曲线或比较处理后样本的完整性分层变化。

7 实验流程C：荧光酶标仪检测

7.1 适用场景

        适用于平底96孔板的高通量比较，适合处理前后差异分析、条件筛选及重复实验统计。

7.2 样本浓度调整

（1）大肠杆菌悬液（活菌和死菌）调整至2×10^8个细菌/ml，约对应0.06 OD670。

（2）金黄色葡萄球菌悬液（活菌和死菌）调整至2×10^7个细菌/ml，约对应0.3 OD670。

（3）用于荧光酶标仪检测时，金黄色葡萄球菌悬液浓度通常比大肠杆菌低10倍。

7.3 活/死比例样本配制

        在16×125 mm高硼硅玻璃培养管中配制5组不同活/死比例细菌悬液，每个样本总体积为2 ml。

7.4 染色步骤

（1）在微量离心管内分别加入6 µl组分A（SYTO 9）和6 µl组分B（PI），混匀。

（2）将上述12 µl染料预混液加入2 ml无菌dH2O中，制备2×染色混合液。

（3）每孔加入100 µl细菌悬液混合物，建议每个制备物设置3个平行孔。

（4）96孔板边缘孔宜留空或加空白，以减少边缘效应造成的假读数。

（5）每孔再加入100 µl 2×染色混合液，上下吹打充分混匀。

（6）室温避光孵育15 min。

7.5 荧光测定与数据分析

（1）以约485 nm为激发波长，约530 nm为发射波长，测定绿色荧光。

（2）以约485 nm为激发波长，约630 nm为发射波长，测定红色荧光。

（3）计算绿/红荧光比值：RatioG/R = Fcell,em1 / Fcell,em2。

（4）以活菌比例为横坐标，以RatioG/R为纵坐标绘图，用于建立校准关系或比较样本处理前后完整性变化。

8 结果判读

8.1 基本判读逻辑

（1）绿色主导：更稳妥地解释为膜完整群为主。

（2）红色主导：更稳妥地解释为膜受损群为主。

（3）红绿混合：更常提示过渡损伤群、局部异质性或不同损伤阶段并存。

（4）总体弱信号：优先回查样本量、前处理、染料比例、孵育时间及背景干扰。

8.2 不同样本类型的解释注意事项

（1）革兰阳性菌早期损伤阶段未必立即形成强红信号，短时间点评估时更应关注过渡群变化。

（2）革兰阴性菌通常更容易形成清晰的红绿分层，但外膜损伤仍不必然等同于不可逆死亡。

（3）酵母和真菌的细胞体积、细胞壁组成及芽生状态均会影响阈值设定，不能直接套用细菌条件。

（4）生物膜样本更应关注表层/深层和局部区域的损伤分布，而不是单独看总体红绿比值。

（5）复杂基质样本应更关注处理前后相对变化，而不宜直接给出绝对活性结论。复杂样本常带有颗粒、自发荧光和非微生物核酸污染，检测前宜洗涤、低速去杂、过滤或适度离心富集。

9 质控要点

9.1 染料与孵育控制

（1）同一批实验中应保持SYTO 9与PI配比一致。

（2）所有样本应保持一致的避光时间、孵育时间和检测间隔。

（3）不要通过单纯提高某一染料比例来追求更亮信号，否则会改变联合染色后的主导关系。

9.2 样本一致性控制

（1）活菌组、死菌组及混合组进入染色前应统一菌体浓度。

（2）样本团聚会影响显微观察和定量平台读数，应尽量保证分散均匀。

（3）复杂样本中的颗粒和碎片背景会抬高假阳性信号，应优先通过前处理和空白对照识别。

9.3 仪器参数控制

（1）显微分析中应固定曝光、增益和视野采集策略。

（2）荧光度计和酶标仪检测中应固定激发/发射窗口和积分区间。

（3）建立曲线时，建议使用同一批次染料、同一批次活/死菌制备物和同类比色皿或板型。

10 常见问题与原因分析

10.1 绿色信号过强，红色群不明显

（1）SYTO 9比例过高。

（2）PI加入不足或孵育时间过短。

（3）死菌对照制备不充分，膜损伤程度不足。

10.2 红色背景偏高

（1）PI比例过高。

（2）样本碎片过多或背景核酸污染明显。

（3）复杂基质未充分去杂。

10.3 红绿混合群比例过大

（1）可能存在真实的过渡损伤群。

（2）可能存在不同损伤阶段并存。

（3）也可能与染料配比不稳定、样本浓度不一致或阈值设置不合理有关。

10.4 总体信号偏弱

（1）菌量不足。

（2）染色不足或孵育时间不合适。

（3）样本停留时间过长导致信号衰减。

（4）应优先回查前处理、染色条件和检测参数。

11 安全与操作规范

11.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）涉及异丙醇、乙醇、SDS等试剂时，应按化学品安全规范操作。

11.2 样本与废弃物处理

（1）含菌样、染料和有机处理液的废弃物应分类收集。

（2）所有废弃物应按实验室生物安全和化学安全要求规范处置。

12 SYTO 9与PI联合活死染色相关产品表

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[1] 采用碘化丙啶DNA染色法进行流式细胞术细胞周期分析