引言

         硼酸、环状硼酸和苯并氧硼烷等药效团具有共同的配位化学特征：硼中心能够在三配位、近似三角平面的状态与四配位、近似四面体的状态之间转换。三配位硼具有电子缺陷和路易斯酸性，可以接受含氧亲核基团提供的电子对；形成硼—氧键后，硼的配位数和局部空间几何随之改变。[1,2]

         生物活性位点可以利用不同的含氧基团稳定四配位硼。硼替佐米和法硼巴坦分别与催化苏氨酸和丝氨酸形成可逆共价加合物，使硼进入近四面体配位状态，并利用水解酶原本用于稳定四面体反应状态的结合环境；他伐硼罗则与转运核糖核酸末端腺苷核糖的 2′,3′-二醇形成环状硼酸酯型加合物，将转运核糖核酸捕获在亮氨酰-转运核糖核酸合成酶的编辑位点；苯氧基苯并氧硼烷类磷酸二酯酶4抑制剂 AN2898 则通过锌离子/镁离子双金属催化中心所组织的水分子与硼配位，形成四面体硼结构。[3–11]

         这些作用模式具有共同的选择性基础：硼中心的电子性质和配位平衡决定其能够形成的结合状态，活性位点对含氧基团和硼中心进行空间预组织，外围分子骨架则控制化合物进入特定结合口袋并确定硼中心的位置和取向。由此，硼中心的反应性、四配位几何、靶点微环境和分子骨架识别共同构成含硼药效团的药理选择性。

1. 三配位—四配位转换是硼药效团的化学基础

         典型有机硼酸可表示为 R–B(OH)₂。中性状态下，硼通常呈三配位、近似三角平面结构，并具有能够接受电子对的空轨道，因此表现出 Lewis 酸性。羟基、羟基负离子以及其他适当的含氧或含氮亲核体可以与硼发生配位或加成，使硼进入四配位状态。[2]

在水溶液中，有机硼酸的酸碱平衡可用总体反应表示为：

         R–B(OH)₂ + H₂O ⇌ [R–B(OH)₃]⁻ + H⁺

         因此，硼酸的 pKₐ与水向硼中心配位以及四配位羟基硼酸盐物种的形成有关。pH、取代基电子效应和环结构都会改变三配位与四配位硼物种之间的相对稳定性。[2]

1.2 可逆 B–O 加合物与局部反应选择性

         硼酸能够与醇、邻二醇以及酶活性位点中的含氧亲核基团形成可逆 B–O 加合物。药物外围结构首先与结合口袋发生非共价识别，使硼中心与目标含氧基团达到合适的距离和取向；随         后形成四配位硼结构，进一步稳定复合物。

这一过程可以概括为：

         分子骨架识别 → 活性位点预组织 → 硼中心配位或亲核加成 → 四配位加合物稳定

         因此，硼中心的反应性决定可以形成何种加合物，而靶点选择性取决于整个结合位点能否有效定位并稳定这一反应状态。

2. 四面体硼如何模拟水解反应状态

2.1 从平面羰基到四面体中间体

         Ser/Thr 水解酶通常利用活化的 Ser–OH 或 Thr–OH 对底物羰基进行亲核攻击。原本近似平面的羰基碳随之转变为四面体结构，并产生氧阴离子型中间体。酶活性位点中的氧阴离子孔和氢键网络能够稳定这一反应状态。

基本过程可表示为：

         平面羰基底物 → Ser/Thr 亲核攻击 → 四面体中间体 → 后续酰基转移或键断裂

         硼酸进入相似的催化环境后，活性位点中的亲核氧可以攻击电子缺陷的硼，使三配位硼转变为四配位结构。形成的四面体硼及其周围氧原子的空间排列可以与酶正常催化过程中形成的四面体反应状态相匹配。

         四配位硼加合物在几何和电荷分布上接近催化过程中的四面体高能状态，因此可作为相应反应状态的稳定模拟物。晶体结构捕获的是这种稳定抑制复合物，而非瞬时过渡态本身。[1–3]

         Matthews等在subtilisin BPN′与硼酸抑制剂的晶体结构中观察到，催化Ser221的Oγ与硼直接成键，其中一个硼酸氧位于氧阴离子孔，为硼酸加合物模拟水解反应四面体状态提供了早期结构证据。[3]

2.2 环状硼酸对 β-内酰胺水解四面体状态的模拟

         β-内酰胺酶进一步说明了这种几何匹配。丝氨酸 β-内酰胺酶（serine β-lactamase，SBL）利用催化 Ser 进行亲核攻击；金属 β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase，MBL）则主要利用 Zn²⁺活化的水或羟基进攻底物。两类酶的催化装置不同，但 β-内酰胺环水解均经过具有相似小分子几何特征的第一四面体中间体。

         Cahill 等研究发现，环状硼酸能够抑制不同类别的 β-内酰胺酶，并提出其作用基础是模拟 SBL 和 MBL 催化过程中共有的第一四面体中间体。[5] 原论文 Figure 1 的 A、B 分别给出两类 β-内酰胺酶的水解途径，C 则比较环状硼酸与头孢氨苄水解四面体中间体的结构关系。

图1. 环状硼酸对 β-内酰胺酶催化四面体中间体的模拟。

         （A）丝氨酸 β-内酰胺酶催化头孢菌素水解的基本过程；（B）金属 β-内酰胺酶催化头孢菌素水解的基本过程。两类酶采用不同的催化机制，但均形成具有共同小分子结构特征的第一四面体中间体 EI₁。（C）研究中的两种环状硼酸以及以头孢氨苄为例表示的共同第一四面体中间体。环状硼酸以四配位硼结构模拟这一反应状态。[5]

         来源： Cahill, S. T.; Cain, R.; Wang, D. Y.; et al. Cyclic Boronates Inhibit All Classes of β-Lactamases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2017, 61, e02260-16, Figure 1；原论文采用Creative Commons Attribution 4.0 International License。

         图1显示，硼酸抑制剂受到活性位点识别的并非孤立的硼原子，而是四面体硼、含氧配位基团以及外围骨架共同形成的三维状态。这一原理同样适用于后续开发的环状硼酸 β-内酰胺酶抑制剂。

3. 硼替佐米与法硼巴坦：四配位硼在不同水解酶中的识别方式

3.1 硼替佐米与蛋白酶体苏氨酸1

         20S 蛋白酶体的催化性 β 亚基属于 N 端苏氨酸水解酶，成熟亚基以 N 端苏氨酸1（Thr1）的侧链羟基作为催化亲核基团。Groll 等解析的酵母 20S 蛋白酶体—硼替佐米复合物〔蛋白质结构数据库编号（PDB）2F16〕显示，硼替佐米的硼酸基进入催化中心，苏氨酸1侧链 Oγ 原子与硼形成 B–O 可逆共价连接，使硼形成四配位加合物。[4]

         在这一加合物中，硼酸基的含氧基团进一步与催化中心形成氢键：其中一个氧与构成氧阴离子稳定环境的甘氨酸47主链酰胺氮相互作用，另一个氧与苏氨酸1的 N 端氨基相互作用。硼替佐米的肽样部分则占据蛋白酶体的底物识别区域，通过氢键和疏水相互作用稳定结合构象。[4]

         硼替佐米对蛋白酶体的结合同时依赖苏氨酸1与硼形成的四配位可逆共价加合物，以及肽样骨架与底物结合亚位点之间的空间和非共价匹配。前者稳定催化中心中的结合状态，后者影响硼酸基能否以合适的位置和方向接近催化苏氨酸。

3.2 法硼巴坦与β-内酰胺酶丝氨酸70

         法硼巴坦（vaborbactam）是环状硼酸类β-内酰胺酶抑制剂，可抑制包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）在内的A类丝氨酸β-内酰胺酶。[6,7] 法硼巴坦与KPC-2的晶体结构分辨率达到1.25 Å〔PDB 6V7I〕，为其结合方式提供了结构证据。[7]

         在该复合物中，催化丝氨酸70（Ser70）的侧链Oγ原子与硼形成可逆共价键，使硼形成四配位构型。法硼巴坦的环外羟基氧进入由Ser70和苏氨酸237（Thr237）的主链酰胺NH构成的氧阴离子孔，并与二者形成氢键；环内氧还与Thr237的主链酰胺NH形成附加氢键。羧酸、酰胺等外围基团进一步与活性位点残基形成极性相互作用。[7]

         结构比较表明，法硼巴坦中环外羟基氧和环内氧的总体空间位置更接近A类β-内酰胺酶酰化步骤的四面体过渡状态模型，而非去酰化步骤的相应状态。因此，Ser70–O–B可逆共价连接、四配位硼的几何结构以及氧阴离子孔对含氧基团的稳定作用共同构成其结合基础。[7]

         动力学研究进一步表明，活性位点外围残基会影响法硼巴坦的抑制过程。替换KPC-2的色氨酸105（W105）可显著改变共价加合物的形成效率（k₂/K），而对解离速率的影响相对较小，说明该残基主要影响初始结合和/或共价加合物形成，对已形成加合物的解离影响较小。不同A类β-内酰胺酶之间的解离速率差异，可能与Ser70–O–B连接以及氧阴离子孔氢键对加合物的局部稳定作用有关。[7]

         硼替佐米和法硼巴坦均利用催化羟基与硼形成四配位可逆共价加合物，但蛋白酶体与β-内酰胺酶对外围分子骨架、底物识别区域和局部氢键网络的要求不同。因此，相近的硼配位化学可以用于不同酶靶点，具体的靶点识别仍取决于整个分子与结合口袋的结构匹配。

4. 他伐硼罗：通过 A76 核糖 2′,3′-二醇捕获转运核糖核酸

4.1 共价加合物形成于他伐硼罗与转运核糖核酸之间

         他伐硼罗（tavaborole，早期研究编号 AN2690）属于苯并氧硼烷类抗真菌药物，其作用靶点为亮氨酰-转运核糖核酸合成酶的编辑位点。

         亮氨酰-转运核糖核酸合成酶负责将亮氨酸连接到相应的转运核糖核酸，并利用编辑结构域清除错误氨酰化产物。他伐硼罗进入编辑位点后，其硼中心与转运核糖核酸 3′端腺苷 A76 核糖的 2′-O 和 3′-O形成环状硼酸酯型加合物，使转运核糖核酸滞留在编辑构象中，从而阻断正常催化周转。[8]

其基本过程可表示为：

         转运核糖核酸进入编辑位点

         → 他伐硼罗与 A76 核糖接近

         → A76 核糖 2′-O、3′-O 与硼形成环状加合物

         → 转运核糖核酸被稳定在编辑构象中

         Liu 等在后续结构研究中用反应式表示了这一过程，原论文 Figure 6A 为他伐硼罗与转运核糖核酸 A76〔或作为模型的 5′-腺苷酸〕在编辑位点中形成加合物的示意。原文同时指出，他伐硼罗通过与 A76 共价连接而阻止转运核糖核酸离开编辑构象。

图2. 他伐硼罗与转运核糖核酸末端 A76 核糖形成加合物的反应模式。

         他伐硼罗的硼中心与 A76 核糖的 2′-O 和 3′-O形成环状硼酸酯型加合物，使转运核糖核酸被捕获在亮氨酰-转运核糖核酸合成酶的编辑位点。该反应构成氧硼烷转运核糖核酸捕获机制的化学基础。[8,9]

         来源： Liu, R.-J.; Long, T.; Li, H.; et al. Nucleic Acids Research 2020, 48, 4946–4959, Figure 6A；CC BY 4.0。

         他伐硼罗的结合还受到编辑位点空间环境的影响，药物与 A76 在结合位点中的相对位置有利于硼中心与核糖形成并稳定环状加合物。与硼替佐米和法硼巴坦不同，该体系中与硼直接形成可逆共价加合物的是酶所结合的转运核糖核酸底物，而不是酶本身的催化氨基酸残基。

4.2 环结构与芳环取代调节苯并氧硼烷的pKₐ和二醇结合

         Tomsho等测得母体苯并氧硼烷在水溶液中的pKₐ为 7.34 ± 0.02；作为参照，苯硼酸的pKₐ约为 8.8。将五元环扩展为六元环类似物后，pKₐ升至 8.40 ± 0.03；在五元环3位引入偕二甲基后，pKₐ为 8.32 ± 0.03。[10]

         原研究将母体苯并氧硼烷较低的pKₐ归因于五元环对中性三角平面硼构型产生的几何约束。硼中心离子化并转变为四面体构型后，这种环张力得到缓解。六元环对硼中心造成的几何扭曲较小；3,3-偕二甲基效应则可能增大硼中心的键角并减轻键角扭曲，使离子化相对不利，因此两种结构变化均使pKₐ升高。[10]

         芳环取代基也能通过电子效应调节苯并氧硼烷的pKₐ。Tomsho等进一步以5′-腺苷酸（5′-AMP）作为tRNA末端腺苷的简化模型，测定母体及两种代表性芳环取代苯并氧硼烷与其核糖二醇的结合常数。结果显示，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，随着芳环取代基吸电子效应增强，苯并氧硼烷的pKₐ降低，与5′-AMP的结合增强。作者将这两种变化均归因于硼中心周围电子密度降低后，阴离子四面体产物的稳定性提高。[10]

上述结构—性质关系可分为两条相互关联的路径：

环尺寸或3,3-偕二甲基取代

         → 改变硼中心的几何约束

         → 改变pKₐ

芳环取代基电子效应

         → 同时调节pKₐ和5′-AMP核糖二醇结合

         在实际亮氨酰-tRNA合成酶体系中，这些在溶液中测得的酸碱和二醇结合性质还需要与编辑位点对他伐硼罗和A76的空间预组织共同作用，才能有效形成并稳定A76环状加合物，并参与相应的靶点识别。

5. 双金属中心识别：磷酸二酯酶4利用活化水形成四配位硼

         磷酸二酯酶4催化3′,5′-环磷酸腺苷水解，其催化中心含有 Zn²⁺和 Mg²⁺，双金属中心共同组织并活化参与催化的水分子。

         克立硼罗（AN2728）属于苯氧基苯并氧硼烷类磷酸二酯酶4抑制剂。Freund 等研究了 AN2728 及其相关化合物 AN2898，发现二者均表现为竞争性、可逆的磷酸二酯酶4抑制剂。AN2898 与磷酸二酯酶4B的共晶结构〔蛋白质结构数据库编号 3O0J，分辨率 1.95 Å〕直接显示了该类化合物的硼中心结合方式。[11]

         在该结构中，由 Zn²⁺和 Mg²⁺共同组织和活化的水分子与 AN2898 的硼原子配位，使硼形成四配位、近四面体构型。AN2898 的稠合苯环和二氰基苯氧基部分同时与催化口袋中的疏水区域发生作用。[11]

         将该结构与5′-腺苷酸在磷酸二酯酶4活性位点中的结构叠合后，可以观察到 AN2898 的四面体硼基团与5′-腺苷酸的磷酸基占据近似重叠的位置，并与双金属中心形成相似的空间关系。[11]

其主要连接关系可表示为：

         Zn²⁺/Mg²⁺双金属中心 → 活化水 → 硼中心配位 → 四配位硼形成

         该体系不依赖硼与蛋白质氨基酸侧链形成直接共价键，而是利用双金属中心活化水将硼中心定位于催化区域，外围芳香结构进一步稳定抑制剂在结合口袋中的构象。

         双金属中心配位本身不足以解释该系列相对于其他磷酸二酯酶的PDE4选择性；外围分子骨架与活性位点其他区域的相互作用同样参与选择性的形成。[11]

6. 硼中心药理选择性的共同基础

         前述四类体系虽然利用不同的含氧组分形成四配位硼，但其选择性都由硼中心性质、靶点空间环境和外围分子骨架共同决定。

6.1 硼中心反应性需要与靶点环境匹配

         硼中心的路易斯酸性、pKₐ、环结构和取代基电子效应都会影响四配位物种形成的倾向。[10] 这些物理化学参数决定硼中心可参与的配位过程，但单独改变其中一个参数并不能直接预测药理活性；实际结合还取决于靶点提供的局部环境。

6.2 活性位点的空间预组织有利于目标加合物形成

         硼中心与含氧基团形成稳定加合物，需要二者在结合位点中具有适宜的距离和取向。蛋白质或核酸结合位点通过限制配体构象并组织含氧组分，提高目标四配位状态形成和稳定的可能性。

         这种空间预组织使具有一般含氧配体结合能力的硼中心在特定靶点环境中表现出选择性。

6.3 外围分子骨架控制硼中心的靶点定位

         硼药效团通常只是整个分子结构的一部分。外围的肽样结构、芳香环、羧酸、酰胺及其他取代基参与初始非共价识别并限制结合构象，从而控制硼中心在活性位点中的位置和方向。

因此，相似的四配位硼化学可以出现在不同靶点中，而具体靶点选择性取决于整个分子与结合口袋的结构匹配。

6.4 结合动力学影响加合物形成与靶点占据时间

         可逆共价或配位加合物处于动态平衡，其抑制行为不仅取决于平衡结合强度，还受到加合物形成效率和解离速率的影响。加合物形成过程影响靶点占据建立的速度，解离过程则影响自由抑制剂浓度降低后复合物能够维持的时间。

         法硼巴坦与KPC-2的研究表明，替换色氨酸105（W105）可显著改变可逆共价复合物的形成效率参数k₂/K，而对解离速率的影响相对较小。这说明W105相关相互作用主要影响初始非共价结合和/或共价加合物形成，对已形成加合物的解离影响较小。[7]

         对于已形成的可逆加合物，较慢的解离通常对应较长的驻留时间和靶点占据时间。不过，驻留时间反映的是药物—靶点复合物的动力学稳定性，不能单独等同于体内药理作用持续时间，后者还受到药物暴露和靶点周转等因素影响。

         因此，对可逆含硼抑制剂的评价可以结合加合物形成效率、解离速率、驻留时间和快速稀释后的酶活性恢复情况，而不局限于单一孵育时间下测得的IC₅₀。

7. 硼中心参与结合机制的实验验证

7.1 复合物结构揭示硼中心的结合位点与配位构型

         共晶或复合物结构能够直接显示与硼相连或配位的原子、硼中心的四配位几何，以及硼药效团在活性位点中的位置。

本文涉及的代表结构包括：

         ①硼替佐米–20S蛋白酶体：蛋白质结构数据库编号 2F16；[4]

         ②法硼巴坦–KPC-2：6V7I；[7]

         ③他伐硼罗–亮氨酰-转运核糖核酸合成酶–转运核糖核酸复合物：2V0G；[8]

         ④AN2898–磷酸二酯酶4B：3O0J。[11]

         其中，2V0G为嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）LeuRS–tRNA–AN2690复合物结构，直接显示AN2690的硼中心与tRNA末端A76核糖2′、3′位氧原子形成加合物；他伐硼罗的抗真菌靶点则由酵母胞质LeuRS的生化实验支持。[8]

7.2 动力学和稀释实验验证结合的可逆性

         预孵育时间依赖、加合物形成和解离速率测定以及快速稀释实验，可以判断含硼抑制剂形成的结合状态是否可逆，并区分不同的结合动力学行为。

AN2898 与磷酸二酯酶4B预孵育后，经 200倍稀释可立即恢复约86%的酶活性，支持该抑制作用具有可逆性。[11]

         因此，动力学测定能够补充静态结构所不能提供的加合物形成、持续和解离信息。

7.3 结构对照和溶液测定验证硼中心的功能贡献

         结构类似物可以用于检验活性是否依赖硼中心及其四配位几何。在磷酸二酯酶4体系中，以不含硼的环状半缩醛结构替代氧硼烷环后，AN2913 的酶抑制和细胞因子抑制活性明显下降，支持硼中心及其四配位结构对该系列活性的贡献。[11]

         对于苯并氧硼烷系列，pKₐ测定和二醇结合常数可以进一步将结构修饰与硼中心离子化及二醇结合能力联系起来。Tomsho 等的研究表明，芳环电子效应不仅影响 pKₐ，也会系统影响与5′-腺苷酸核糖二醇的结合。[10]

8. 硼中心药理选择性、四面体状态模拟、顺式二醇捕获与双金属中心识别相关代表化学品

表1. 四面体状态模拟与可逆共价抑制相关化学品

表2. 苯并氧硼烷配位平衡与顺式二醇捕获相关化学品

表3. 磷酸二酯酶4双金属中心识别相关化学品

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参考文献

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