细胞活死染色与凋亡检测技术
细胞活死染色与凋亡检测技术
在药物筛选、毒理评价、免疫细胞功能研究以及干细胞相关实验中，对细胞存活状态和死亡方式的准确评估是最基础也是最关键的技术环节之一。相比传统的台盼蓝计数等方法，基于荧光探针的细胞活力与细胞死亡检测可以在荧光显微镜或流式细胞仪平台上区分活细胞、早期凋亡细胞以及晚期凋亡/坏死细胞，并能够与多色免疫分型、细胞周期分析等实验策略进行组合，已逐渐成为现代细胞生物学实验室的常规检测手段。
一、细胞活死染色与凋亡检测的生物学基础
从检测维度来看，细胞命运大致可以分为三类：
1）存活细胞（viable cells）
细胞膜完整，胞质内代谢酶（如酯酶）活性正常，ATP水平维持在相对稳定范围；核酸结构完整，染色质分布均匀。
2）凋亡细胞（apoptotic cells）
早期凋亡阶段，细胞膜整体仍保持完整，但膜磷脂分布不对称性被破坏，细胞表面出现磷脂翻转等特征，细胞核染色质开始固缩和边集；晚期凋亡阶段，膜通透性增加，DNA发生片段化，并形成凋亡小体。
3）坏死或晚期死亡细胞（necrotic/late apoptotic cells）
细胞膜通透性显著增加，胞内物质外泄，DNA裸露，细胞形态多表现为膨胀或崩解。
不同类型的细胞活力/死亡检测荧光探针，正是围绕这些差异进行设计：有的依赖细胞膜完整性，只能进入膜受损细胞；有的依赖胞内酯酶活性，只在活细胞内被转化为荧光产物；还有的对染色质结构和DNA完整性高度敏感，可用于识别凋亡特征。
二、常用的细胞活死染色与凋亡检测染料的原理概述
1.膜完整性指示型探针：PI与7-AAD
（1）碘化丙啶Propidium iodide（PI，CAS：25535-16-4）
PI是带正电的核酸嵌入染料，可与DNA、RNA结合并显著增强红色荧光。其对完整细胞膜通透性较差，一般仅能进入膜受损细胞，因此常用于标记死亡细胞或在流式细胞术中用于排除死亡细胞。配合RNase处理后，可基于PI染色DNA含量进行细胞周期分析。典型产品形式为碘化丙啶染色液（如P1373641），既适合流式细胞周期分析，也适合显微镜下进行死亡细胞排除。
（2）7-氨基放线菌素D（7-AAD，CAS：7240-37-1）
7-AAD为远红区域荧光的DNA染料，偏好结合GC含量较高的序列，同样难以穿透完整的细胞膜，多用于标记膜完整性受损细胞。由于其发射波长较PI更偏红，在多色流式方案中更容易与FITC、PE等常用荧光抗体搭配，减少光谱重叠。7-AAD活性染色液（A1372406）是多色流式免疫分型中常用的“活细胞门控”染料，用于在分析表面标志物前先排除死亡细胞。
2.核酸结构/染色质敏感型探针：Hoechst、DAPI、吖啶橙
（1）Hoechst 33342（CAS：23491-52-3）与Hoechst 33258（CAS：23491-45-4）
Hoechst 33342和Hoechst 33258均为苯并咪唑类DNA小沟结合染料，偏好AT丰富序列，结合后蓝色荧光显著增强。Hoechst 33342脂溶性更高，能够较好地穿透完整细胞膜，适合活细胞核染色与凋亡检测；Hoechst 33258对完整细胞膜通透性略差，多用于固定细胞或轻度透化处理后的染色。凋亡细胞在Hoechst染色后常呈现核固缩、边集和碎裂等形态，荧光信号局部增强，是经典的凋亡形态学标志。Hoechst 33342/PI与Hoechst 33258/PI细胞凋亡检测试剂盒（如H1373483、H1492197）可在显微镜下一次性获得总细胞核、凋亡核形态及膜完整性信息。
（2）DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole，CAS：47165-04-8）
DAPI为DNA小沟结合染料，与AT富集区域结合时发出明亮的蓝色荧光。由于对完整细胞膜通透性较低，通常用于固定细胞或组织切片的核染色。在流式细胞术中，DAPI也可用作蓝光通道的“死亡细胞排除”染料。DAPI染色液（D1372407）适合用于免疫荧光实验中的核染色或流式检测中与多色抗体共同使用。
（3）吖啶橙Acridine Orange（AO，CAS：65-61-2）
吖啶橙为可渗透细胞膜的阳离子型荧光染料，与双链DNA结合时发绿色荧光，与单链DNA或RNA结合时发红橙色荧光。该特性可用于反映细胞周期进程和核酸含量变化。在凋亡细胞中，AO染色常表现为核固缩、高亮颗粒状信号或碎裂的小体。吖啶橙染色试剂盒（A1456513）及AO/PI双染试剂盒（A1492198）广泛应用于通过显微成像对细胞核形态与存活状态进行同时评估。
3.代谢/酯酶活性指示型探针：Calcein-AM
Calcein-AM（钙黄绿素-AM，CAS：148504-34-1）是Calcein的非荧光脂溶性前体，可自由穿透细胞膜进入细胞内部。在活细胞中，胞质酯酶将其水解为带强负电荷的Calcein，后者被滞留在细胞内并产生明亮的绿色荧光。在死亡或严重受损细胞中，由于酯酶活性下降或膜完整性破坏，Calcein荧光信号极弱或缺失。钙黄绿素-AM溶液（C1456514）常与PI联用，构成“Calcein-AM/PI双染细胞活力检测方案”：活细胞呈绿色荧光，死亡细胞呈红色荧光，适用于药物毒性评估、培养条件优化及高通量筛选。
三、典型染色方案与应用场景
1.PI或7-AAD单染：死亡细胞排除与细胞周期分析
在多色流式免疫分型实验中，可在上机前用7-AAD活性染色液（A1372406）或PI染色液短暂孵育细胞，通过“活力门控”排除膜受损细胞，使后续表型分析更加准确。配合RNase处理的PI染色则可用于细胞周期分析，一次实验获得活细胞比例与G₀/G₁、S、G₂/M阶段分布。
2.Hoechst/PI双染：凋亡阶段与晚期死亡区分
Hoechst 33342/PI和Hoechst 33258/PI细胞凋亡检测试剂盒（如H1373483、H1492197）适合在荧光显微镜或高内涵成像平台上观察凋亡细胞的核形态变化并区分不同死亡阶段。通常可按以下逻辑判读：Hoechst阳性且PI阴性，但核染色质固缩或碎裂为早期凋亡；Hoechst与PI双阳性则多为晚期凋亡或坏死细胞。
3.AO/PI双染：形态学与活力信息一并获取
AO/PI双染试剂盒（A1492198）通过AO染色提供DNA/RNA相关信息，并以PI标记膜受损细胞。在一次染色中即可同时获取细胞核形态、染色质状态与活力/死亡状态，适合进行凋亡分级展示和半定量统计。
4.Calcein-AM/PI双染：活力定量与毒性评估
使用钙黄绿素-AM溶液（C1456514）与PI组合，可以构建直观的“活细胞绿、死细胞红”的双染方案。该方法既适用于显微成像，也可以在多孔板格式下通过荧光酶标仪或高内涵成像系统进行定量分析，常用于药物毒性筛选、细胞存活率评估以及培养条件优化。
5.DAPI/Hoechst核染色液：作为基础模块灵活组合
DAPI染色液（D1372407）、Hoechst 33258染色液（H1373484）和Hoechst 33342染色液（O1501802）可作为免疫荧光和组织切片实验中的基础核染色工具，也可与PI、7-AAD等死亡染料组合使用，用于在多色实验中同时获得核信息和活力/死亡信息。例如，在流式细胞术中使用DAPI排除死亡细胞，将红光通道保留给PE、APC等抗体标记。
四、阿拉丁相关产品
产品名称 | 货号 | 级别和纯度 | 应用 |
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒 | BioReagent,用于显微镜,生物染色剂,适用于免疫荧光(IF),适用于荧光分析,用于细胞培养,即用型,for DNA and RNA applications,无菌过滤 | 用于细胞周期分布及细胞凋亡的检测，适用于荧光显微镜和流式细胞术。 | |
吖啶橙染色试剂盒 | BioReagent,生物染色剂,用于显微镜 | 用于吖啶橙核酸染色，可进行活/死细胞鉴别及细胞凋亡观察。 | |
Hoechst 33342/PI细胞凋亡检测试剂盒 | BioReagent,生物染色剂,用于显微镜,即用型 | 用于Hoechst 33342/PI双染，区分活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡/坏死细胞。 | |
AO/PI双染试剂盒 | 适用于免疫荧光(IF),BioReagent,生物染色剂,用于显微镜,适用于荧光分析,用于细胞培养 | 用于AO/PI双染活/死细胞鉴定，适合细胞凋亡检测和细胞毒性评价。 | |
Hoechst 33258/PI细胞凋亡检测试剂盒 | BioReagent,生物染色剂,用于显微镜,即用型 | 用于Hoechst 33258与PI联合染色，观察核形态并区分凋亡与坏死细胞。 | |
7-AAD 活性染色液 | 无菌过滤,适用于免疫荧光(IF),BioReagent,即用型,生物染色剂,适用于荧光分析,生物染料级,用于显微镜,用于细胞培养,无菌,0.1mg/mL,2.5μL/test | 用于流式细胞术中死细胞排除和细胞活性检测，可结合细胞周期分析。 | |
碘化丙啶染色液 (PI) | BioReagent,用于显微镜,无菌过滤,适用于免疫荧光(IF),1.0 mg/mL | 用于细胞核酸荧光染色，常用于细胞活性、凋亡及细胞周期分析。 | |
DAPI染色液 | BioReagent,用于显微镜,无菌过滤,适用于免疫荧光(IF),1.0 mg/mL | 用于细胞核特异性DNA染色，适用于细胞和组织切片的荧光显微观察。 | |
碘化丙啶 (PI) 染色液 (即用型) | BioReagent,用于显微镜,即用型,无菌过滤,适用于免疫荧光(IF) | 即用型PI染色液，用于快速细胞死亡、凋亡检测及细胞周期分析。 | |
Hoechst 33258 染色液 | BioReagent,生物染色剂,生物染料级,适用于免疫荧光(IF),适用于荧光分析,用于细胞培养,用于显微镜,即用型,1.0 mg/mL in H₂O | 用于AT富集区段的核染色，适合细胞凋亡研究和荧光成像。 | |
Hoechst 33342 染色液 | 适用于免疫荧光(IF),BioReagent,即用型,生物染色剂,适用于荧光分析,生物染料级,用于显微镜,用于细胞培养,1.0 mg/ml in H₂O | 细胞可渗透DNA染料，用于活细胞或固定细胞核染色及细胞计数。 | |
钙黄绿素-AM溶液 | BioReagent,用于显微镜,生物染色剂,适用于免疫荧光(IF),适用于荧光分析,用于细胞培养,无菌过滤,2 mM in DMSO | 用于活细胞荧光标记和细胞活性检测。 | |
碘化丙啶（PI） | ≥98%(HPLC) | 用于配制PI染色液，适合细胞凋亡、细胞周期及核酸染色实验。 | |
碘化丙啶（PI） | ≥94% | 用于制备用于流式和荧光显微的PI核酸染色工作液。 | |
钙黄绿素乙酰氧基甲酯 | 适用于荧光分析, ≥96%(HPLC) | 用于荧光分析中细胞内 Ca²⁺或细胞活性的检测及活细胞成像。 | |
碘化丙啶（PI） | 10mM in DMSO | 10 mM PI储备液，用于直接稀释进行细胞核酸荧光染色和细胞活性检测。 | |
7-氨基放线菌素D(7-AAD) | Moligand™, ≥97%(HPLC) | 用于流式细胞术中晚期凋亡/坏死细胞检出及DNA含量分析。 | |
赫斯特荧光染料33342 | 10mM in DMSO | 用于配制Hoechst 33342核染色工作液，适合细胞计数和凋亡形态学观察。 | |
赫斯特荧光染料33342 | ≥98% | 高纯度Hoechst 33342，用于高灵敏度DNA荧光标记和核染色。 | |
赫斯特荧光染料33342，三盐酸盐 | Cell-permeable, adenine-thymine-specific fluorescent stain. | 细胞可渗透、AT偏好性DNA染料，用于核染色及染色质结构研究。 | |
Bisbenzimide H 33258 Fluorochrome, Trihydrochloride | Membrane-permeable, adenine-thymine-specific fluorescent stain. | 用于H33258 DNA核染色及细胞凋亡核形态观察。 | |
Hoechst 33258 UltraPure 超纯级 | ≥99%(HPLC) | 超纯级Hoechst 33258，用于背景要求严格的荧光成像和核酸定量。 | |
Hoechst 33258 trihydrochloride | Moligand™, 10 mM in DMSO | 10 mM Hoechst 33258储备液，用于细胞核DNA染色及细胞周期分析。 | |
Hoechst 33258染色液（即用型） | 5ug/ml in H2O | 即用型Hoechst 33258染色液，用于快速核染色和细胞凋亡观察。 | |
赫斯特荧光染料，33258 | ≥98% | 用于配制Hoechst 33258荧光核染色工作液，适合荧光显微和流式细胞术。 | |
DAPI | Moligand™, ≥98% | 用于DNA特异性核染色，可应用于免疫荧光、细胞凋亡和细胞周期研究。 | |
吖啶橙 | Moligand™, 10 mM in DMSO | 吖啶橙10 mM储备液，用于核酸荧光染色及活/死细胞区分。 | |
吖啶橙 盐酸盐 | ≥99% | 用于制备吖啶橙核酸染色工作液，适合细胞凋亡和自噬相关研究。 | |
吖啶橙 盐酸盐（水合物） | ≥99% | 用于活细胞及酸性囊泡（如溶酶体、自噬小体）的荧光标记。 | |
钙黄绿素-AM | ≥90%(HPLC) | 用于活细胞荧光标记和细胞活性/细胞毒性检测。 |
基于细胞膜完整性、核酸结构以及胞内代谢活性等不同检测原理，PI、7-AAD、DAPI、Hoechst系列、吖啶橙和Calcein-AM等荧光探针共同构成了细胞活力与细胞死亡及凋亡检测的基本工具体系。在此基础上，通过合理组合单一染色液与复合双染试剂盒（如Hoechst/PI细胞凋亡检测试剂盒、AO/PI双染试剂盒、Calcein-AM/PI活力检测方案等），可以在显微、流式以及高内涵成像平台上灵活搭建适配不同实验目的的检测策略，实现对细胞存活比例、凋亡进程以及晚期坏死状态的多维度解析，为药物筛选、毒理评价、免疫学研究以及干细胞与再生医学等领域提供可靠、直观且可定量的实验数据支撑。
危险品化学品经营许可证（带存储）