本试剂盒为革兰氏阴性或阳性细菌DNA的提取提供了一个简单快速的解决方案,该方法采用超顺磁性的磁性粒子纯化技术,提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提,操作简单方便,纯化的DNA可直接用于酶切、PCR、测序和标记等相关实验。其处理后的产物用于科研检测使用。
产品组分表：
| M1373368 | Component | 48 T | Storage |
| M1373368A | RNase A | 6mg | 2-8 ℃ |
| M1373368B | 酶溶解液ESB | 1ml | RT |
| M1373368C | 裂解液 AL | 25ml | RT |
| M1373368D | 裂解结合液 BLT | 33ml | RT |
| M1373368E | 磁珠MBVB | 1.1 ml | 2-8 ℃ |
| M1373368F | 洗涤液 BW1 | 40 ml | RT |
| M1373368G | 洗涤液CW1 | 40 ml | RT |
| M1373368H | 洗涤液DW2 | 40 ml | RT |
| M1373368I | 洗脱液DE | 6ml | RT |
| M1373368J | 蛋白酶K | 1.1ml | 2-8 ℃ |
| M1373368K | 研磨管(ZB_M3) | 48×0.9g | RT |
适配仪器：
手工提取
储存条件及有效期：
室温(15~30℃)保存,有效期为12个月。蛋白酶K、RNase A干粉室温运输和保存,长期保存(>3个月)放置于-20~8℃。磁珠MBVB长期保存(>7天)放置于2~8℃。
注意事项：
1. 使用前请仔细阅读本说明书。
2. 本试剂盒中的多种缓冲液含有刺激性的胍盐,务必戴上手套,并按照安全标准预防措施来处理。不要让缓冲液接触到皮肤、眼睛以及黏膜,如果确实发生,请立即用大量清水清洗并就医。
3. 如因气温较低,溶液出现沉淀,需要30℃水浴至沉淀完全溶解后方可使用。
4. 如因气温较低,裂解液AL出现沉淀,可60℃水浴至沉淀完全溶解后使用。
5. 如因气温较低,用力振荡后磁珠无法重悬,请勿使用。
6. 本试剂盒中的多种缓冲液含胍盐,请勿用氧化性消毒剂如次氯酸钠进行处理,否则会释放有毒气体,须按医疗废物进行处理。
备注
1)本试剂盒需配套使用,不同批号试剂盒中各组分不可以互换或混用。
2)自备试验器材:
恒温水浴锅(当溶液出现沉淀时使用)、干式恒温仪、磁力架(1.5/2.0ml)、1.5/2.0ml无菌无核酸酶离心管、各种规格移液器及Tips(20、200、1000μl)
样本要求
1. 适用标本类型:0.5~1ml细菌、真菌培养液。
2. 标本保存和运输:标本可立即用于测试,也可以保存于-70℃或更低温度待测,保存期为6个月,应避免反复冻融。标本运输采用冷链运输。
3. 冻融要求:速冻速融,避免反复冻融。
使用方法
1. 试剂准备
1.1 实验前检查溶液是否有沉淀,磁珠是否能重悬。
1.2 溶解RNase A(10mg/ml):加入0.6ml酶溶解液ESB,溶解RNase A至终浓度为10mg/ml,颠倒混匀/轻柔涡旋让RNase A充分溶解,溶解后的RNase A须保存于-20~8℃。
2. 操作步骤
磁分离操作建议(步骤2.9开始):离心管置于磁力架后,轻轻地左右旋转,待磁珠聚集于贴近磁力架的管壁后,轻轻地颠倒磁力架数次,使管盖上的磁珠也聚集到管壁,静置数分钟至溶液澄清即可(静置时长视磁力架磁性而定)。
2.1 取0.5~1ml细菌/真菌培养液(约106~103个菌)于1.5ml离心管,10,000×g离心1分钟,收集细菌,尽量吸弃上清。
2.2 根据不同样本类型选择对应步骤进行处理
A. 非真菌类、易裂解细菌DNA提取:加入200~300μl裂解液AL和20μl蛋白酶K,高速涡旋1分钟混匀。
易裂解细菌:革兰氏阴性菌如大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌等。
B. 真菌类、难裂解细菌DNA提取:加入350~450μl裂解液AL和20μl蛋白酶K,涡旋混匀后瞬时离心,将所有溶液转至研磨管(ZB_M3)中,在涡旋仪最大转速涡旋或转移至震荡破碎仪高速研磨样本10~15分钟(不同品牌震荡破碎仪,请选择仪器推荐程序)。
真菌:酵母菌、假丝酵母、黄曲霉、白地霉、抗生菌等。
难裂解细菌:革兰氏阳性菌如葡萄球菌、肠球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。
2.3 65℃振荡温浴15~30分钟,若恒温仪无振荡功能,可在温浴期间每5分钟取出涡旋1次,每次10~20秒。
2.4 加入10μl RNase A至消化液中,涡旋混匀后室温放置10~15分钟(如样本量过大造成RNA残留,此时建议降低样本量)。
2.5 若裂解后样本出现浑浊,可涡旋混匀后10,000×g离心1分钟;若裂解后溶液清澈透明,涡旋混匀后瞬时离心。
2.6 将上清转至新的1.5ml离心管,小心吸取,避免吸到沉淀(否则可能导致RNA残留)。
2.7 加入600μl裂解结合液BLT,高速涡旋混匀10秒。
2.8 加入20μl磁珠MBVB,振荡或涡旋5~7分钟使磁珠吸附DNA。
2.9 转移至磁力架上进行磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.10 加入700μl洗涤液BW1,浸泡30秒,涡旋10秒打散磁珠后转至磁力架进行磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.11 加入700μl洗涤液CW1,涡旋10秒打散磁珠后转至磁力架进行磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.12 加入700μl洗涤液DW2,涡旋10秒打散磁珠后转至磁力架进行磁分离至溶液澄清,吸弃溶液。
2.13 掌上离心机瞬时离心后,转至磁力架上吸附至溶液澄清,充分吸弃所有溶液,打开管盖,空气干燥3~5分钟。
注意:乙醇残留会抑制后续的酶反应,晾干时要确保乙醇挥发干净。切勿干燥过久,以免影响后续洗脱效果。
2.14 加入50~100μl洗脱液,高速涡旋2~3分钟打散磁珠。
2.15 60℃温浴5分钟,然后高速涡旋30秒。重复洗脱1次可增加产量。
2.16 瞬时离心收集管盖液滴至管中,转移至磁力架上进行磁分离至溶液澄清。
2.17 把基因组DNA溶液转移至新的离心管中待用。如果不立即使用,请存储于-15 ~- 25℃,长期保存请放置于-70℃或更低的温度。
方法的局限性
1. 对于某些取样不佳的样本,提取产物中可能存在少量杂质抑制PCR扩增。
2. 样本核酸的提取效果与样本收集、处理、运输和保存质量密切相关,其中任何失误都将会导致结果不准确。
ZJ25F0825801
危险品化学品经营许可证（带存储）