DNA提取的核心目标是从细胞、组织、血液、植物、微生物或环境样本中获得完整、纯净且适合下游实验的DNA。方法选择应同时考虑样本类型、DNA片段完整性、抑制物去除能力、通量需求和下游应用要求。

关键词：DNA提取；基因组DNA；酚氯仿抽提；硅胶柱法；磁珠法；CTAB法；DNA纯化；核酸质量评价

1 DNA提取的目标与质量要求

1.1 DNA提取不只是获得核酸

        DNA提取需要同时完成细胞裂解、核酸释放、蛋白和脂质去除、RNA降解、抑制物清除、DNA富集和缓冲液置换。不同方法在DNA完整性、纯度、回收率和操作效率上存在差异，不能只用“是否提取得到DNA”判断方法优劣。

（1）产量

        DNA产量与样本量、细胞数量、裂解效率和回收方式相关。高产量方法适合基因组建库、Southern blot、大量PCR模板制备和宏基因组分析，但高产量不代表高纯度。

（2）纯度

        DNA纯度主要受蛋白、酚、盐、乙醇、多糖、多酚、血红素和腐殖酸等杂质影响。PCR、qPCR、酶切、连接、测序和文库构建对抑制物残留较敏感。

（3）完整性

        高分子量DNA提取要求降低机械剪切、反复冻融和强烈涡旋。长读长测序、光学图谱和大插入片段文库构建对DNA完整性要求高于普通PCR。

（4）适配性

        不同下游实验对DNA质量要求不同。普通PCR可接受一定片段化DNA；qPCR更关注抑制物去除；NGS建库要求稳定片段分布和低污染；长读长测序则更强调高分子量DNA保留。

表1 DNA提取结果的主要评价指标

1.2 不同样本的提取难点

（1）动物组织和细胞

        动物细胞膜结构相对容易裂解，主要难点在于蛋白、脂质和RNA去除。组织样本还需充分匀浆，避免局部裂解不完全。

（2）血液和体液

        血液样本中血红素、抗凝剂和蛋白可能抑制PCR。白细胞基因组DNA提取需兼顾红细胞去除、蛋白消化和盐分清除。

（3）植物样本

        植物样本含细胞壁、多糖、多酚和次生代谢物。CTAB法常用于植物DNA提取，重点在于去除多糖和多酚，避免DNA褐变、胶状沉淀或PCR抑制。

（4）细菌和真菌

        细菌和真菌细胞壁结构较强。革兰阳性菌、酵母和丝状真菌通常需要溶菌酶、蛋白酶K、机械破碎或冻融辅助裂解。

（5）土壤、粪便和环境样本

        环境样本含腐殖酸、多酚、胆盐、复杂多糖和金属离子等PCR抑制物。此类样本不宜只追求DNA产量，抑制物清除能力更关键。

2 DNA提取的基本流程

2.1 样本裂解与核酸释放

        DNA提取的第一步是破坏细胞膜、细胞壁或核膜，使DNA释放到溶液中。裂解体系通常由去垢剂、盐、螯合剂和蛋白酶组成。

（1）去垢剂裂解

        SDS、Triton X-100或其他去垢剂可破坏细胞膜和核膜，并使蛋白变性。SDS裂解能力强，适合多数动物组织、细胞和部分微生物样本。

（2）蛋白酶K消化

        蛋白酶K可降解组蛋白、核酸酶和结构蛋白，提高DNA释放效率并减少DNA降解。组织、血液、细胞和拭子样本中常需配合蛋白酶K消化。

（3）机械破碎

        研磨、匀浆、珠磨和液氮研磨可增强植物、真菌和细菌裂解。机械处理过强会导致DNA剪切，长片段DNA提取时需降低剪切强度。

（4）螯合剂保护

        EDTA可络合Mg²⁺等二价离子，抑制依赖金属离子的核酸酶活性。DNA提取缓冲液中常加入EDTA以降低DNA降解风险。

2.2 蛋白、RNA和抑制物去除

        裂解后样品中含有蛋白、脂质、RNA、盐和样本特异性抑制物。去除这些杂质是影响下游实验成败的关键步骤。

（1）蛋白去除

        酚氯仿抽提、盐析、蛋白酶K消化和硅胶膜洗涤均可降低蛋白污染。若A260/A280偏低，通常提示蛋白或酚类污染。

（2）RNA去除

        RNase A可降解RNA，避免RNA导致DNA浓度虚高或影响凝胶判读。基因组DNA提取中若需要准确浓度和清晰条带，应设置RNase处理。

（3）多糖和多酚去除

        植物样本中多糖会导致DNA溶液黏稠，多酚氧化后会与DNA结合并抑制PCR。CTAB、PVP、高盐条件和β-巯基乙醇常用于改善植物DNA纯度。

（4）腐殖酸和胆盐去除

        土壤、粪便和环境样本中的腐殖酸和胆盐会抑制PCR。硅胶柱、磁珠纯化和专用抑制物去除步骤更适合此类复杂基质。

2.3 DNA富集、洗涤与洗脱

（1）沉淀富集

        乙醇或异丙醇可在盐存在下促使DNA沉淀。沉淀法适合较大体积样本和高分子量DNA回收，但盐和有机溶剂残留需充分去除。

（2）硅胶结合

        在高盐或变性盐条件下，DNA可结合硅胶膜或硅胶颗粒。洗涤后用低盐缓冲液或无核酸酶水洗脱，适合快速、标准化提取。

（3）磁珠结合

        磁珠法通过可逆结合DNA实现自动化纯化，适合高通量样本和自动化平台。通过调节PEG、盐浓度和磁珠比例，可控制DNA回收片段范围。

（4）洗脱控制

        洗脱液体积影响DNA浓度，洗脱温度和孵育时间影响回收率。用于酶切、PCR和测序时，洗脱液中盐、乙醇和螯合剂残留需控制在下游反应可接受范围内。

3 常见DNA提取方法比较

3.1 酚-氯仿抽提法

（1）原理与流程

        酚-氯仿抽提法利用有机溶剂使蛋白变性并进入有机相或界面，DNA保留在水相，再通过乙醇或异丙醇沉淀回收DNA。该方法适合获得较高纯度和较完整的DNA。

（2）优势

        酚-氯仿法对蛋白去除能力强，适合组织、细胞、部分微生物和需要高分子量DNA的样本。若操作温和，可保留较长DNA片段。

（3）局限

        酚和氯仿具有毒性和腐蚀性，对操作安全和废液处理要求高。抽提过程耗时，界面吸取不当会造成蛋白污染或DNA损失，残留酚还会抑制PCR和酶反应。

3.2 盐析法

（1）原理与流程

        盐析法利用高盐条件使蛋白聚集沉淀，DNA留在上清中，再通过醇沉淀回收。常用于血液、细胞和组织样本的基因组DNA提取。

（2）优势

        盐析法避免使用酚氯仿，安全性高于有机抽提法，成本较低，适合批量提取中高质量基因组DNA。

（3）局限

        蛋白去除能力依赖盐浓度、混匀和离心条件。若样本基质复杂，残留蛋白、盐和RNA可能影响纯度。该方法对多酚、多糖和腐殖酸等抑制物去除能力有限。

3.3 硅胶柱法

（1）原理与流程

        硅胶柱法在高盐或变性盐条件下使DNA结合硅胶膜，杂质经洗涤液去除，DNA再以低盐缓冲液或无核酸酶水洗脱。

（2）优势

        硅胶柱法操作快速、重复性好、流程标准化程度高，适合PCR、qPCR、常规测序和分子克隆前的DNA制备。多数样本可通过不同裂解液和柱膜体系适配。

（3）局限

        柱膜结合容量有限，样本量过大或DNA含量过高时可能降低回收率。离心柱操作可能造成较长DNA片段剪切，不适合所有高分子量DNA应用。

3.4 磁珠法

（1）原理与流程

        磁珠法利用磁性颗粒表面与DNA在特定盐和PEG条件下的可逆结合实现核酸纯化。磁分离替代离心步骤，可适配自动化平台。

（2）优势

        磁珠法通量高、自动化程度高、重复性好，适合临床样本、微量样本、PCR产物纯化、NGS文库构建和多样本批量提取。通过调节磁珠比例还可进行片段选择。

（3）局限

        磁珠残留、乙醇残留或洗涤不充分会影响PCR和测序。磁珠法成本通常高于传统方法，对混匀、磁分离时间和自动化程序一致性要求较高。

3.5 CTAB法

（1）原理与流程

        CTAB法常用于植物DNA提取。CTAB可与多糖等杂质分离，并在高盐条件下帮助DNA保留于溶液相或后续沉淀回收。PVP和还原剂可进一步降低多酚干扰。

（2）优势

        CTAB法对富含多糖、多酚和次生代谢物的植物样本适用性较好，尤其适合叶片、种子、果实和木本植物组织DNA提取。

（3）局限

        方法步骤较多，操作时间较长，对样本研磨、温度、高盐条件和抽提过程依赖明显。若多酚去除不足，DNA可能褐变并抑制PCR。

3.6 快速裂解法

（1）原理与流程

        快速裂解法通过加热、碱裂解、Chelex树脂或简化裂解液直接释放DNA，通常省略复杂纯化步骤。该方法更强调速度而非高纯度。

（2）优势

        快速裂解法操作简便、耗时短、成本低，适合菌落PCR、初步基因分型、现场快速筛查和样本初筛。

（3）局限

        所得DNA纯度较低，蛋白、盐、细胞碎片和抑制物残留较多。该方法不适合高质量测序、酶切、长期保存或高准确度定量需求。

表2 常见DNA提取方法比较

4 不同样本的DNA提取策略

4.1 动物组织和细胞

        动物组织样本应先充分剪碎、研磨或匀浆，再通过SDS和蛋白酶K裂解。若用于普通PCR和qPCR，硅胶柱法和磁珠法效率较高；若用于高分子量DNA提取，应减少涡旋和强力吹打，避免长片段DNA剪切。

4.2 血液样本

        血液DNA提取主要目标是从白细胞中获得基因组DNA。红细胞裂解、蛋白酶K消化和抗凝剂残留控制是关键环节。肝素抗凝样本可能抑制PCR，EDTA抗凝样本更常用于分子检测。

4.3 植物样本

        植物组织应在低温或液氮条件下充分研磨，减少核酸酶活性和多酚氧化。CTAB法适合多糖和多酚含量较高的样本；硅胶柱法适合通量较高、样本复杂度较低的植物材料。

4.4 细菌和真菌样本

        细菌DNA提取需根据细胞壁结构调整裂解条件。革兰阴性菌相对容易裂解，革兰阳性菌常需溶菌酶或机械破碎；真菌样本通常需要珠磨、液氮研磨或酶解辅助。

4.5 土壤、粪便和环境样本

        环境样本的关键问题是抑制物去除。土壤腐殖酸、粪便胆盐和复杂有机物会抑制PCR。此类样本宜采用含抑制物去除步骤的硅胶柱或磁珠方案，并通过加标扩增判断抑制效应。

表3 不同样本类型的DNA提取关注点

5 DNA质量评价方法

5.1 紫外分光光度法

        紫外分光光度法通过A260估算DNA浓度，并利用A260/A280和A260/A230评估纯度。A260/A280偏低常提示蛋白、酚或其他有机物污染；A260/A230偏低常提示盐、胍盐、酚、多糖或腐殖酸残留。

5.2 荧光定量法

        荧光染料可选择性结合双链DNA，定量结果通常比A260更适合低浓度样本和复杂基质样本。若样品含RNA、游离核苷酸或吸光背景，荧光定量更适合评估真实双链DNA浓度。

5.3 琼脂糖凝胶电泳

        凝胶电泳可观察DNA完整性、片段大小和降解情况。高质量基因组DNA通常表现为高分子量主带，降解样本则出现拖尾或弥散条带。RNA污染也可通过低分子区域条带或背景判断。

5.4 下游扩增验证

        PCR或qPCR是判断DNA是否含抑制物的有效方法。若DNA浓度正常但扩增失败，应重点排查盐、乙醇、酚、腐殖酸、血红素或多糖残留。

表4 DNA提取结果的质量评价方法

6 常见问题与优化策略

6.1 DNA产量低

（1）裂解不充分

        组织未充分研磨、细胞壁未破坏或蛋白酶K消化不足会导致DNA释放不完全。应根据样本类型增加研磨、酶解或裂解时间。

（2）结合或沉淀效率低

        硅胶柱法中乙醇比例、胍盐浓度和上样量影响结合效率；沉淀法中盐浓度、醇比例和低温孵育影响DNA回收。

（3）洗脱不充分

        洗脱体积过小、孵育时间不足或洗脱液未充分接触膜面会降低回收率。可适当延长洗脱时间或进行二次洗脱。

6.2 DNA纯度差

（1）蛋白污染

        A260/A280偏低时，应考虑蛋白酶K消化不足、酚氯仿界面吸取不当或洗涤不足。增加蛋白消化或优化抽提步骤可改善结果。

（2）盐和有机物残留

        A260/A230偏低常见于胍盐、乙醇、酚、多糖或腐殖酸残留。应延长洗涤、增加干燥时间或采用二次纯化。

（3）RNA污染

        RNA残留会导致A260读数偏高，并影响凝胶条带判断。基因组DNA提取中可加入RNase A处理。

6.3 DNA降解或片段化

（1）核酸酶活性

        样本保存不当、裂解延迟或EDTA不足可能导致DNA降解。样本应低温保存，并尽快完成裂解和核酸酶失活。

（2）机械剪切

        剧烈涡旋、反复吹打、过度珠磨和小孔径移液器吸打会导致高分子量DNA断裂。长片段DNA提取应采用宽口枪头和温和混匀。

（3）反复冻融

        反复冻融会增加DNA断裂风险。长期保存时应分装DNA，避免多次冻融。

6.4 下游PCR失败

        DNA浓度正常但PCR失败，通常提示抑制物残留或模板质量不佳。植物、土壤、粪便和血液样本尤其需要关注多糖、多酚、腐殖酸、胆盐和血红素抑制。可通过稀释模板、二次纯化或加标扩增定位问题。

表5 DNA提取常见问题与排查方向

7 相关产品与材料选型

表6 DNA提取相关试剂盒与配套材料

8 常见问题

8.1 DNA提取选择试剂盒还是传统方法？

        常规PCR、qPCR和批量样本更适合试剂盒或磁珠法；需要高分子量DNA或方法成本控制时，可选择酚氯仿法、盐析法或优化后的手工方案。

8.2 A260/A280正常是否代表DNA质量一定好？

        不一定。A260/A280主要反映蛋白污染情况，不能充分判断盐、多糖、腐殖酸、乙醇残留和DNA完整性。应结合A260/A230、凝胶电泳和下游扩增结果综合评价。

8.3 DNA浓度高但PCR扩增失败是什么原因？

        常见原因是抑制物残留，如酚、盐、乙醇、多糖、多酚、腐殖酸、血红素或胆盐。可尝试稀释模板、二次纯化或进行加标扩增验证。

8.4 植物DNA提取为什么容易出现黏稠或褐变？

        黏稠多与多糖残留有关，褐变通常与多酚氧化有关。CTAB、PVP、β-巯基乙醇和低温研磨可改善植物DNA提取质量。

8.5 长片段DNA提取需要注意什么？

        应减少涡旋、强力吹打和过度机械破碎，尽量使用温和混匀、宽口枪头和低剪切操作。样本保存和裂解过程也需降低核酸酶活性。

8.6 磁珠法DNA提取为什么会影响PCR？

        磁珠残留、乙醇残留、盐残留或洗脱不充分都可能影响PCR。操作中应保证磁分离完全、洗涤充分、乙醇充分挥发，并避免吸入磁珠。

8.7 DNA提取后如何保存？

        短期可置于4℃或-20℃，长期建议-20℃或-80℃保存。DNA应使用低盐缓冲液或无核酸酶水溶解，避免反复冻融，重要样本宜分装保存。

        DNA提取方法的选择应围绕样本类型、DNA完整性、抑制物去除和下游实验需求展开。酚氯仿法适合高纯度和高分子量DNA，硅胶柱法适合快速标准化提取，磁珠法适合高通量和自动化，CTAB法适合植物样本，快速裂解法适合初筛实验。

更多相关文章，详见下方：

[1] RNA提取

[2] RNA提取和反转录实验方案

[3] RNA提取技术：方法体系、操作流程与质量控制要点

[4] 如何选择血浆游离RNA提取试剂