1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立细菌荚膜负染色的常规操作流程，适用于有荚膜细菌的形态学观察与初步鉴别，可用于微生物实验室常规检测、教学示教及菌株表型判断。

1.2 方法原理

（1）荚膜负染色的核心是利用“菌体着色、背景着色、荚膜不着色”的对比关系显示荚膜轮廓。

（2）复红等碱性染料可与菌体表面的酸性基团结合，使菌体呈红色。

（3）黑色素、印度墨汁或其他背景负染液主要附着于载玻片背景，不进入荚膜结构，使背景呈灰色或黑色。

（4）荚膜因与染料亲和力弱，通常不被明显染色，因此在红色菌体与暗色背景之间表现为无色透明圈。

1.3 染色质量要求

（1）菌体着色清晰，形态完整。

（2）背景均匀，无明显颗粒和结块。

（3）荚膜轮廓完整，可见清晰透明圈，不应因加热或机械损伤而塌陷或脱落。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）固体培养基上的新鲜菌落。

（2）液体培养基中的细菌悬液。

（3）适用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等有荚膜细菌的观察。

2.2 主要试剂

（1）复红染色液，常用 0.5%～1.0% 碱性复红水溶液。

（2）黑色素溶液、印度墨汁或其他背景负染液。

（3）蒸馏水。

2.3 耗材与器材

（1）洁净载玻片。

（2）接种环。

（3）酒精灯。

（4）吸水纸或滤纸。

（5）光学显微镜。

（6）香柏油。

3 样本与染液准备

3.1 样本要求

（1）待检细菌宜选用新鲜培养物，优先采用对数生长期样本。

（2）菌龄过长可导致荚膜结构不完整或染色效果减弱。

（3）样本应避免过度机械搅拌，以免破坏荚膜。

3.2 菌液浓度要求

（1）菌悬液应分散均匀，不应出现明显团聚。

（2）浓度以透过涂片仍可辨认载玻片下文字为宜。

（3）菌液过浓会导致菌体堆积、荚膜重叠，过稀则不利于镜下寻找目标。

3.3 染液要求

（1）复红染色液应澄清、无明显沉淀。

（2）背景负染液使用前宜过滤，以减少颗粒杂质干扰。

（3）染液应按实验室规定保存，使用过程中避免污染。

4 实验流程

4.1 制备菌液涂片

（1）取洁净载玻片，在中央滴加 1 小滴蒸馏水。

（2）用灭菌并冷却后的接种环挑取少量待检细菌，置于水滴中轻轻研磨混匀，形成均匀菌悬液。

（3）将菌悬液轻轻涂布成直径约 1～2 cm 的薄层。

（4）涂布动作应轻柔，避免破坏荚膜结构。

4.2 涂片干燥

（1）将涂片平放，自然晾干。

（2）必要时可用冷风辅助干燥。

（3）严禁火焰加热固定或热风烘烤，以免引起菌体收缩和荚膜变形。

4.3 菌体染色

（1）待涂片完全干燥后，用复红染色液均匀覆盖菌膜区域。

（2）室温染色 2～3 min。

（3）染色结束后，将载玻片倾斜，用缓慢流动的水轻轻冲洗至流出液无明显颜色。

（4）用吸水纸轻轻吸去表面水分，再自然晾干或冷风吹干。

4.4 背景负染

（1）待复红染色后的涂片完全干燥后，在涂片一侧边缘滴加 1 小滴背景负染液。

（2）取另一张洁净载玻片作为推片，使其边缘接触液滴后，以约 15°～30° 夹角平稳向前推动，使背景负染液形成均匀薄层。

（3）亦可直接在已染色区域滴加少量背景负染液后，自边缘吸去多余液体，但应以形成均匀背景为原则。

（4）背景负染后将载玻片平放，自然干燥。

4.5 显微镜观察

（1）先用低倍镜找到涂片区域。

（2）再用高倍镜选择菌体分布均匀、背景清晰的区域。

（3）滴加香柏油后转换油镜观察。

（4）油镜下仅使用细准焦螺旋调焦，避免压坏标本。

5 染色结果

5.1 背景

（1）背景呈灰色至黑色。

（2）背景应较均匀，不应有大量颗粒或结块。

5.2 菌体

（1）菌体呈红色。

（2）形态应较完整，可辨认球菌、杆菌等基本形态特征。

5.3 荚膜

（1）荚膜位于菌体周围。

（2）表现为无色透明圈。

（3）透明圈应位于红色菌体与暗色背景之间，边界清楚时提示荚膜显示良好。

6 结果判读要点

6.1 荚膜判读

（1）菌体周围出现连续、清晰、无色透明环带时，可判定为荚膜阳性表现。

（2）透明圈大小可因细菌种类、培养状态及样本处理方式不同而存在差异。

6.2 菌体判读

（1）菌体应着色均匀且轮廓完整。

（2）若菌体着色过浅，可能影响荚膜与菌体之间的边界识别。

6.3 背景判读

（1）背景应连续、均匀且暗色适中。

（2）若背景过浅，荚膜透明圈对比不足；若背景过深或颗粒过多，也会干扰判读。

7 常见问题与原因分析

7.1 看不到荚膜

（1）涂片干燥过程中使用了加热固定，导致荚膜塌陷或脱落。

（2）菌龄过长，荚膜结构不完整。

（3）样本本身无明显荚膜或培养条件不利于荚膜形成。

（1）背景负染液未过滤。

（2）染液老化或污染。

（3）推片动作不均匀，导致局部堆积。

7.3 菌体着色浅

（1）复红染色时间不足。

（2）染色前涂片未完全干燥。

（3）冲洗过强导致部分菌体脱落或褪色。

7.4 菌体堆积严重

（1）菌悬液浓度过高。

（2）涂布过厚。

（3）应减少取菌量并重新制片。

8 应用范围

8.1 常规微生物学观察

（1）用于有荚膜细菌的形态学显示。

（2）适用于教学和常规实验室初步筛查。

8.2 菌株表型判断

（1）可用于区分有荚膜与无荚膜菌株。

（2）可作为细菌鉴定和培养状态评估的辅助依据。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理待检菌株时应遵循相应微生物安全要求。

9.2 操作注意事项

（1）接种环使用前后应充分灭菌。

（2）染色全过程应避免剧烈擦拭、过强水流和高温处理。

9.3 废弃物处理

（1）污染载玻片、吸水纸和接种耗材应按微生物污染物处理规范处置。

（2）剩余菌液和染色废液应按实验室生物及化学废弃物要求分类收集。

10 相关试剂选型

表1 细菌荚膜负染色相关试剂选型