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细胞样本保存体系对形态保持、抗凝稳定与检测结果的影响
细胞样本保存体系对形态保持、抗凝稳定与检测结果的影响
细胞样本进入保存体系后，检测结果已不再仅由原始生物学状态决定，而是同时受到抗凝方式、渗透压环境、缓冲条件、代谢抑制程度和处理时效的共同影响。保存体系选择不当时，首先受损的通常不是“是否还能检测”，而是形态边界、细胞分散性、抗凝完整性和结果解释的可信度。
关键词：细胞样本；保存体系；形态保持；抗凝稳定；EDTA；肝素；枸橼酸盐；流式细胞术；细胞冻存
1 细胞样本保存体系的作用基础
1.1 保存体系的功能构成
（1）抗凝组分
抗凝组分的作用并不只是阻止肉眼可见凝固，而是抑制Ca2+依赖凝血过程、减少微凝块和纤维蛋白细丝形成，并维持细胞在检测前的均一分散状态。对血液来源样本而言，抗凝体系的充分性直接决定自动计数、流式上机和显微镜判读的基础质量。
（2）缓冲与渗透保护组分
缓冲盐、糖类、蛋白或其他保护因子决定细胞外液环境是否接近原始生理状态。pH偏移、离子强度变化及渗透压异常都会引起细胞收缩、肿胀、膜起皱、颗粒重排和核浆边界模糊，从而影响形态学、散射参数和部分定量指标。
（3）代谢抑制与稳定组分
部分保存体系通过降低代谢速率、减缓膜转运或限制酶活性来延长样本稳定窗口。这类设计有助于减少运输过程中的持续代谢，但也可能同步改变膜表面分子暴露、离子重新分布及部分活细胞检测指标。
（4）固定或半固定组分
某些体系通过轻度固定、膜稳定或蛋白交联方式维持细胞结构和部分表型，使样本可在延迟上机或跨中心运输条件下保持可分析状态。这类体系通常更适合形态和表型检测，而不适合活性实验、培养实验或多数功能学实验。
1.2 保存体系影响检测结果的三条主要路径
（1）细胞结构改变
保存液一旦改变细胞体积、膜张力、胞质颗粒分布或核染色质状态，形态判读与散射信号就会同时发生变化。
（2）细胞间相互作用改变
抗凝不充分或界面保护不足时，样本中可出现血小板聚集、白细胞黏附、纤维蛋白缠绕和背景碎片堆积，这些变化会直接干扰细胞计数、门控分群和显微镜观察。
（3）分析物持续变化
保存过程中细胞并非完全静止。葡萄糖消耗、乳酸累积、离子外流内流、胞内酶释放和表面抗原衰减，都会使检测值逐步偏离采样时状态。
1.3 评价保存体系时不能只看“能否检测”
（1）是否保持原始形态边界
某些体系可以维持总细胞数，却不能维持形态学判读价值。
（2）是否维持抗凝与分散一致性
样本未必发生肉眼可见凝块，但微凝块、细丝状纤维蛋白和局部聚集已经足以影响定量结果。
（3）是否兼容目标检测方法
适合血细胞计数的体系，不一定适合流式免疫分型；适合流式运输的体系，也不一定适合细胞培养或活性分析。
表1 细胞样本保存体系的核心评价维度
评价维度 | 主要关注点 | 直接影响 |
形态保持 | 细胞体积、膜完整性、核浆边界、颗粒分布 | 形态学判读、显微镜观察、散射特征 |
抗凝稳定 | 是否有微凝块、聚集、纤维蛋白残留 | 计数准确性、流式堵孔风险、分群偏差 |
表型稳定 | 膜抗原、受体暴露、染色一致性 | 流式细胞术、免疫检测 |
代谢稳定 | 葡萄糖消耗、乳酸累积、离子漂移 | 生化配套指标、功能解释 |
活性保持 | 活细胞比例、膜通透性、线粒体状态 | 功能实验、培养、活死染分析 |
时间容忍度 | 室温/低温运输中的稳定时长 | 样本周转与多中心收样 |
2 常见保存体系及其应用差异
2.1 EDTA体系
（1）作用机制
EDTA通过螯合Ca2+抑制凝血级联反应，是血液细胞学检测中应用最广的抗凝体系之一。其优势在于抗凝充分、微凝块风险较低、细胞分散性通常较好。
（2）对形态的影响
EDTA对血细胞计数较友好，但随放置时间延长，部分细胞会逐步出现体积变化和形态边界模糊。例如中性粒细胞核分叶细节减弱、单核细胞胞浆轮廓变钝、血小板肿胀或聚集倾向增加。
（3）适用场景
适合血常规、白细胞分类、部分形态学复核及多数短时细胞计数应用。
（4）局限性
不适合某些Ca2+依赖功能实验，也不适合需要维持特定离子状态或后续活细胞功能分析的场景。个别样本可出现EDTA依赖性血小板聚集，造成血小板假性降低。
2.2 枸橼酸盐与ACD体系
（1）作用机制
枸橼酸盐和ACD体系同样通过结合Ca2+实现抗凝，但其离子环境通常比EDTA更温和，对某些细胞功能和膜状态的扰动相对较小。
（2）对形态和分散性的影响
这类体系在血小板功能、凝血研究和部分细胞制备中更常见。其不足在于稀释效应更明显，定量结果解释需校正，且在常规细胞计数上的表现未必优于EDTA。
（3）适用场景
适合血小板研究、部分免疫细胞分离、细胞治疗前处理及需要较温和抗凝环境的研究型样本。
（4）局限性
若按常规全血定量逻辑直接解释，容易因稀释效应和离子环境差异带来偏差。
2.3 肝素体系
（1）作用机制
肝素通过增强抗凝血酶相关作用抑制凝血过程，与EDTA和枸橼酸盐不同，其并非以强螯合Ca2+为主。
（2）对细胞状态的影响
肝素化样本在某些流式、细胞分离和功能实验中具有优势，尤其适合需要维持较高细胞活性的场景。其问题在于对白细胞计数和形态学判读并不总是最优，且部分染色背景和非特异结合可能增加。
（3）适用场景
适合外周血单个核细胞分离、部分功能学检测、细胞刺激实验前的短时保存。
（4）局限性
不宜将其简单替代EDTA用于常规血细胞形态学判读，也不适合所有免疫检测体系。
2.4 固定型或稳定型保存液
（1）作用机制
这类体系通过轻度固定、膜稳定或蛋白交联维持细胞结构和表面抗原一段时间，使样本在延迟上机条件下仍保持可分析性。
（2）优势
对流式免疫分型、多中心样本转运和延迟检测具有较高价值，可降低运输过程中细胞碎裂、散射漂移和表型丢失。
（3）局限
固定后细胞活性下降，膜通透性改变，部分抗原构象发生变化，因此不适合活细胞功能实验、培养实验和某些依赖天然构象的检测。
2.5 培养基型与冻存型保存体系
（1）培养基型体系
对于体外培养细胞、原代细胞悬液或脆弱细胞样本，培养基型保存体系更适合短时维持膜稳定性和存活率。这类体系对后续培养和功能实验更友好，但抗凝能力有限，不适合直接处理高凝血风险样本。
（2）冻存型体系
冻存体系强调低温下降低冰晶损伤和渗透损伤。其评价重点不在短时形态保持，而在复苏后活率、膜完整性和功能恢复程度。无血清、无蛋白、无DMSO等不同设计，对不同细胞群体的兼容性差异明显。
表2 常见保存体系的应用比较
保存体系 | 主要优势 | 主要局限 | 更适合的检测/应用 |
EDTA | 抗凝充分，计数稳定，分散性较好 | 长时间放置后形态漂移，个别血小板聚集 | 血常规、短时形态学、细胞计数 |
枸橼酸盐/ACD | 抗凝较温和，适合部分功能研究 | 有稀释效应，常规定量需校正 | 血小板研究、细胞分离、研究型样本 |
肝素 | 活性保持较好，适合部分功能实验 | 某些背景干扰和形态学适配性较差 | PBMC分离、功能实验、短时运输 |
固定/稳定液 | 表型与结构保持较好，适合延迟检测 | 不适合活细胞实验 | 流式免疫分型、多中心转运 |
培养基型体系 | 活性友好，利于后续培养 | 抗凝不足，运输要求更高 | 原代细胞、培养细胞、功能检测 |
冻存体系 | 适合长期保存与后续复苏 | 冻融损伤风险高，需优化程序 | 细胞库建立、原代样本保存、功能实验前储存 |
3 保存体系对形态保持的影响
3.1 红细胞与血小板形态变化
（1）红细胞体积和形状
保存体系的渗透压、pH和离子组成可直接改变红细胞体积与膜张力。高渗环境下红细胞易皱缩，低渗环境下则易肿胀。即使总体数量变化不大，MCV、RDW和显微镜下形态判读也可能发生偏移。
（2）血小板肿胀与聚集
血小板对抗凝方式和保存时间高度敏感。EDTA相关血小板肿胀会影响MPV等参数；部分样本中，抗凝剂还可能诱发血小板聚集，造成计数假性降低。
3.2 白细胞形态稳定性
（1）中性粒细胞
保存时间延长后，中性粒细胞首先出现的通常不是数量显著下降，而是核分叶边界变钝、胞浆颗粒辨识度下降和轻度空泡化。
（2）单核细胞
单核细胞对保存体系和温度较敏感，容易出现胞浆边缘不规则、空泡增加和散射特征漂移，因此在流式和形态学两端都较容易受影响。
（3）淋巴细胞
淋巴细胞总体耐受性较高，但在不适当保存条件下仍会出现胞膜完整性下降、细胞收缩和表面抗原衰减，尤其在延迟检测中更明显。
3.3 体液细胞和脆弱细胞样本
（1）脑脊液、胸腹水、灌洗液
这类样本细胞浓度低、细胞脆弱，若缺乏适当保护体系，细胞极易在短时间内碎裂、变形或核固缩。
（2）肿瘤细胞和原代细胞
原代肿瘤细胞、循环肿瘤细胞及某些大型异常细胞对渗透压和机械应力更敏感。保存体系若只强调抗凝而忽视膜保护，往往会使形态学和流式结果同时劣化。
4 保存体系对抗凝稳定的影响
4.1 抗凝充分不等于检测稳定
（1）无肉眼凝块并不代表无干扰
某些样本虽无明显凝块，但已形成微凝块或纤维蛋白细丝，足以影响流式上机、自动计数和细胞分群。
（2）抗凝不均一是常见隐性问题
采样后混匀不足、局部高细胞密度或保存液比例不当，会导致局部凝血先行发生。此类样本肉眼往往不易及时识别。
4.2 不同抗凝体系的稳定性差异
（1）EDTA更偏向常规定量稳定
对血细胞计数而言，EDTA通常仍是最稳定的常规方案。
（2）枸橼酸盐更偏向功能兼容
其优势在于较温和，但定量解释需要更谨慎。
（3）肝素更偏向活性保持
其价值在于保留部分功能状态，但在标准化定量与形态边界方面未必最优。
4.3 运输与温度对抗凝稳定的再放大作用
（1）温度升高
会加快细胞代谢和某些细胞损伤过程，并可能放大抗凝不足带来的微凝块风险。
（2）低温不总是更优
过低温度可导致膜流动性下降、冷诱导聚集或某些细胞亚群活性显著受损。不同保存体系对低温的耐受范围并不一致。
（3）机械震荡
运输中的反复震荡会使边界脆弱的细胞更快破碎，也会让已有微凝块更难在检测前被及时识别。
表3 抗凝稳定与常见干扰表现
干扰表现 | 常见原因 | 对检测的直接影响 |
微凝块 | 抗凝不足、混匀不足、局部凝血 | 计数偏低、堵孔、分群异常 |
纤维蛋白细丝 | 凝血未完全抑制或延迟处理 | 流式背景升高、自动化异常 |
血小板聚集 | 抗凝剂依赖反应、低温、运输扰动 | 血小板假性降低 |
白细胞黏附/团聚 | 保存体系不匹配、界面保护不足 | 白细胞分类失真 |
细胞碎片增加 | 运输时间长、保护不足 | 背景噪声升高、散射分群偏移 |
5 保存体系对检测结果的影响
5.1 对细胞计数结果的影响
（1）总数变化与假性变化
保存时间延长后，细胞总数未必立即大幅下降，但微凝块、聚集和碎裂会造成仪器读数偏移，表现为假性减少或亚群比例异常。
（2）体积参数漂移
细胞体积变化会直接影响MCV、MPV及流式散射参数，因此某些“参数变化”首先反映的是保存体系效应，而非真实生物学变化。
5.2 对流式细胞术结果的影响
（1）散射信号漂移
细胞收缩、肿胀、颗粒重排和碎裂均会改变FSC/SSC分布，使门控边界不再对应采样时状态。
（2）表面抗原衰减或构象改变
部分膜抗原对时间、温度和固定状态敏感。保存体系若只保证“细胞仍在”，并不代表表型读出仍然可信。
（3）非特异背景增加
细胞碎片、死亡细胞、膜通透性变化和未清除纤维蛋白均可提高荧光背景和非特异结合。
5.3 对形态学与显微镜判读的影响
（1）核浆边界模糊
是最常见的时间相关变化之一。
（2）颗粒和空泡表现改变
会影响对活化状态、异常细胞及中毒性改变的判断。
（3）异常细胞识别率下降
细胞一旦失去原始轮廓，异型淋巴细胞、原始细胞和肿瘤细胞的判读敏感性会明显下降。
5.4 对功能检测与培养实验的影响
（1）活性保留不足
固定型和强稳定型体系通常不适合后续培养和功能实验。
（2）代谢读出偏差
保存过程中葡萄糖消耗、乳酸累积和离子重新分布会影响功能解释。
（3）刺激反应性下降
对需做细胞刺激、分泌和增殖实验的样本而言，保存体系的温和程度通常比抗凝强度更重要。
6 保存体系的选择策略
6.1 以常规细胞计数与分类为目标
（1）优先考虑EDTA体系
其在常规血液细胞计数中的稳定性通常最佳。
（2）控制时间窗口
EDTA并不意味着可无限延后检测，形态漂移和血小板相关偏差仍会逐步累积。
6.2 以流式免疫分型为目标
（1）短时检测优先选择温和抗凝体系
若短时间内上机，EDTA或肝素体系均可考虑，但应与目标抗体面板验证兼容性。
（2）延迟检测优先考虑稳定型保存液
尤其在多中心收样或长距离运输场景下，表型稳定通常比活性保持更优先。
6.3 以功能实验或细胞培养为目标
（1）避免固定型体系；
（2）优先考虑肝素或培养基型保存体系；
（3）缩短运输和等待时间。
6.4 以脆弱样本和低细胞数样本为目标
（1）优先考虑具有膜保护和低损伤特征的保存体系；
（2）减少震荡和温度波动；
（3）必要时设置专门的快速处理流程。
表4 不同检测目标下的保存体系选择思路
检测目标 | 更适合的保存体系 | 选择重点 |
常规血细胞计数 | EDTA体系 | 抗凝充分、计数稳定、短时形态保持较好 |
血小板功能或部分研究型样本 | 枸橼酸盐/ACD体系 | 温和抗凝、功能兼容性较好 |
PBMC分离与部分活性实验 | 肝素体系 | 细胞活性保持较好 |
流式延迟上机 | 稳定型/轻固定体系 | 表型与散射稳定性优先 |
原代细胞培养 | 培养基型保存体系 | 活性和膜完整性优先 |
低细胞数脆弱样本 | 保护型低损伤体系 | 减少碎裂和运输损伤 |
7 细胞样本保存体系相关产品
表5 细胞样本保存体系核心试剂表
名称 | CAS号 | 实验环节 | 关键用途 | 使用要点 |
乙二胺四乙酸二钾(K2EDTA) | 抗凝保存 | 用于全血及部分细胞悬液抗凝，维持短时分散状态与计数稳定性 | 适合常规细胞计数与部分形态学检测；放置时间过长可引起体积和形态漂移 | |
乙二胺四乙酸三钾(K3EDTA) | 抗凝保存 | 用于自动化采血和常规血细胞检测体系 | 液体抗凝形式可能带来轻度稀释效应，定量解释时需注意 | |
肝素钠 | 抗凝保存 | 适用于部分活细胞分离、功能实验前处理和短时活性保持 | 更适合功能与分离场景，不宜简单替代常规EDTA体系 | |
肝素锂 | 抗凝保存 | 适用于部分细胞功能分析及短时保存体系 | 对细胞活性保持较友好，但并非所有形态学检测均适配 | |
枸橼酸钠 | 温和抗凝 | 适用于血小板相关研究、温和抗凝及部分研究型样本保存 | 存在稀释效应，常规定量分析需校正 | |
枸橼酸 | ACD/CPD体系配制 | 作为温和抗凝与缓冲体系组成成分 | 通常与枸橼酸钠、葡萄糖联用，不单独作为完整保存液使用 | |
D-葡萄糖 | 能量支持 | 用于ACD等保存体系中提供短时能量支持 | 可延缓部分细胞代谢衰竭，但不能替代完整保护体系 | |
HEPES | 缓冲保护 | 用于维持保存体系pH稳定，减少运输中的酸碱漂移 | 适合短时运输和室温处理条件下的体系稳定化 | |
海藻糖二水合物 | 膜保护/低温保护 | 用于脆弱细胞样本和部分冻存体系的膜稳定保护 | 更适合作为辅助保护组分与蛋白或缓冲体系联用 | |
甘油 | 渗透保护/低温保护 | 用于部分细胞与特殊样本的渗透压保护或低温保护研究 | 浓度需严格控制，过量可引起渗透压损伤 | |
人血清白蛋白(HSA) | 蛋白保护 | 用于临床转化和细胞治疗相关样本保护体系 | 更适合对临床适配性要求较高的体系 | |
多聚甲醛 | 固定保存 | 用于固定细胞结构，维持形态和部分表型稳定 | 固定后不适合活性检测、培养及多数功能实验 | |
DNA酶I | 团聚控制/样本分散 | 用于减少高碎裂样本中游离DNA引起的细胞团聚 | 适合坏死较多或组织消化后样本的分散处理 |
表6 细胞样本保存体系相关产品表
货号 | 名称 | 级别和纯度 | 适用研究方向/用途 |
TCT细胞保存液 | BioReagent,即用型 | 适用于宫颈脱落细胞等细胞学样本保存，用于维持细胞分散状态、形态边界和后续镜检/液基细胞学检测一致性 | |
细胞保存液 | BioReagent,即用型 | 适用于一般细胞样本短时保存与运输，兼顾形态保持和后续检测前的样本稳定性 | |
流式专用细胞保存液Ⅰ型 | BioReagent, 无菌过滤 | 适用于流式细胞术样本保存与延迟上机，用于维持细胞散射特征、降低碎片背景并改善表型检测稳定性 | |
流式专用细胞保存液Ⅰ型 (EDTA-K2抗凝) | BioReagent, 无菌过滤 | 适用于含抗凝要求的流式细胞样本保存，用于兼顾抗凝稳定、细胞分散性和流式检测一致性 | |
UltraBio™ 组织/细胞冻存液 | — | 适用于组织来源细胞和常规细胞样本低温保存与复苏前保护，减少冻融过程中的结构损伤 | |
免分装快速细胞冻存液（无血清） | 无菌过滤, BioReagent, 通过内毒素测试, 即用型, 用于细胞培养 | 适用于需要快速操作和标准化保存流程的细胞冻存，适合对批间一致性要求较高的样本体系 | |
快速细胞冻存液（无血清） | 无菌过滤, BioReagent, 通过内毒素测试, 即用型, 用于细胞培养 | 适用于常规细胞样本无血清冻存保存，降低血清差异对复苏状态的影响 | |
无蛋白非程序细胞冻存液（免疫细胞专用） | 无菌过滤, BioReagent, 通过内毒素测试, 即用型, 用于细胞培养, 无菌 | 适用于免疫细胞冻存保存，兼顾复苏后活率、分散状态和后续功能检测稳定性 | |
无蛋白非程序细胞冻存液（干细胞专用） | 无菌过滤, BioReagent, 通过内毒素测试, 即用型, 用于细胞培养, 无菌 | 适用于干细胞样本冻存，强调对脆弱细胞群体的低损伤保存和复苏兼容性 | |
类器官冻存液 | BioReagent, 无菌过滤, 即用型 | 适用于类器官样本低温保存，适合维持复杂细胞结构体系在冻存-复苏前后的整体稳定性 | |
细胞冻存液 | 1×,无菌,基础型 | 适用于常规细胞样本基础冻存保存，是一般实验室细胞保存的基础型体系 | |
细胞冻存液(无蛋白,无DMSO） | BioReagent, 通过内毒素测试, 用于细胞培养, 无菌 | 适用于对DMSO或外源蛋白敏感的细胞样本保存，便于减少部分体系干扰 | |
细胞冻存液（含血清） | 无菌过滤, BioReagent, 通过内毒素测试, 即用型, 用于细胞培养 | 适用于常规细胞系和部分原代细胞冻存，侧重复苏后活率和膜稳定性保持 | |
ACK红细胞裂解液 (ACK Lysis Buffer) | BioReagent | 适用于含红细胞背景样本的检测前处理，用于去除红细胞干扰、改善白细胞或其他细胞群体检测质量 | |
Gey's红细胞裂解液 (Gey's Lysis Buffer) | BioReagent | 适用于细胞检测前的红细胞去除，适合关注细胞形态背景和分群清晰度的样本前处理 | |
Tris-氯化铵红细胞裂解液 (无菌) | 无菌过滤,BioReagent,无菌 | 适用于流式或细胞分离前处理中的红细胞裂解，降低背景细胞与碎片干扰 | |
红细胞裂解液 | BioReagent, 无菌过滤, 用于细胞培养, 10× | 适用于细胞样本前处理时去除红细胞背景，改善后续计数、流式分析和显微镜观察质量 | |
PBS, DNase&RNase Free | 无菌过滤, BioReagent, 无DNA酶和RNA酶, 即用型, 用于细胞培养, 1× | 适用于细胞样本短时洗涤、重悬和低背景维持，尤其适合对核酸酶污染敏感的细胞前处理场景 | |
PBS溶液,1X | 1X,无菌,pH7.2-7.4 | 适用于细胞样本短时重悬、洗涤和基础等渗环境维持，可作为保存前处理或检测前缓冲体系 | |
预混 PBS 缓冲液，10x | 溶液(透明、无色),最适pH值~7.0 | 适用于细胞样本处理过程中的基础缓冲体系配制，便于在批量实验中统一缓冲条件 |
细胞样本保存体系的选择，直接决定形态保持、抗凝稳定和检测结果解释的可信度。更合理的策略，不是单纯追求更强抗凝或更长保存时间，而是根据检测目标在结构稳定、功能保留和前分析一致性之间进行匹配；对细胞样本而言，保存体系本身就是检测方法的一部分。
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