1 外泌体与细胞外囊泡的基本概念

1.1 外泌体与细胞外囊泡

         细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞释放到细胞外环境中、由脂质双层膜包裹且不能自行复制的颗粒。其内部及膜表面可携带蛋白质、脂质、信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA）及代谢物等成分。

外泌体是按照生物发生途径定义的一类细胞外囊泡，来源于细胞内体系统。其形成过程可表示为：

细胞膜内吞 → 早期内体 → 晚期内体膜向腔内出芽 → 形成腔内囊泡 → 多囊泡体形成 → 多囊泡体与细胞膜融合 → 腔内囊泡释放为外泌体

多囊泡体也可能与溶酶体融合并被降解：

多囊泡体 → 与细胞膜融合并释放外泌体

多囊泡体 → 与溶酶体融合并降解

         内体分选转运复合体（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）、四跨膜蛋白、神经酰胺及Rab家族小GTP酶等可参与囊泡形成、载荷分选、胞内运输和释放，但不同细胞可采用不同的分子途径。

         “外泌体”不能仅根据粒径、杯状形态或CD9、CD63、CD81等蛋白的存在进行确认。小型细胞外囊泡通常指分离后粒径小于约200 nm的囊泡群体，其中可能同时包含内体来源的外泌体和由细胞膜直接出芽形成的小型囊泡。因此，在尚未确认其生物发生来源时，更准确的名称是“细胞外囊泡”或“小型细胞外囊泡”，而不宜笼统称为外泌体。

1.2 市场中的“外泌体原料”可能对应不同物质

护肤品所称的外泌体原料并不一定具有相同的物质基础，常见类型包括：

         ① 分离纯化的细胞外囊泡：经过浓缩和精制，游离蛋白质、培养基成分及非囊泡颗粒得到一定程度去除。

         ② 细胞外囊泡富集组分：囊泡浓度高于原始培养液，但仍可能含有较多游离蛋白质、脂蛋白、核酸和培养基残留。

         ③ 细胞条件培养液或分泌组：除细胞外囊泡外，还含有细胞因子、生长因子、代谢物和可溶性蛋白质。其功效不能全部归因于外泌体。

         ④ 植物来源细胞外囊泡或囊泡样纳米颗粒：来源、膜组成和形成机制与哺乳动物细胞外泌体不同，需要按照实际物质组成进行定义。

         ⑤ 工程化囊泡、细胞外囊泡模拟物或脂质体：通过细胞挤出、人工脂质组装或天然囊泡与脂质体融合等方式制备，不宜直接称为天然外泌体。

2 外泌体来源如何影响原料性质

2.1 主要生物来源

         间充质基质细胞来源细胞外囊泡在组织修复研究中使用较多，但“间充质基质细胞来源”并不能单独证明原料具有抗炎、促胶原或抗衰老作用。不同组织来源、不同供体和不同培养方法所产生的囊泡在组成和效力方面可能存在较大差异。

2.2 来源细胞及培养条件影响细胞外囊泡载荷

细胞能够对部分蛋白质、脂质和RNA进行选择性装载，其载荷受以下因素影响：

         ① 细胞种类及组织来源；

         ② 供体年龄、健康状况和个体差异；

         ③ 细胞传代次数及衰老程度；

         ④ 培养基、血清或无血清培养条件；

         ⑤ 氧浓度、营养水平和细胞密度；

         ⑥ 紫外线、炎症、缺氧及氧化应激；

         ⑦ 二维培养、三维培养或生物反应器培养方式。

         来源细胞的功能状态可能改变囊泡作用方向。例如，健康细胞产生的囊泡可能携带有利于组织稳态的信号，而衰老、炎症或异常细胞产生的囊泡也可能携带促炎、促纤维化或其他非预期信号。

3 外泌体的制备、纯化与质量控制

3.1 从细胞培养液到原料的制备过程

较完整的制备过程可表示为：

         来源细胞筛选与细胞库建立 → 受控培养 → 收集条件培养液 → 去除细胞和较大碎片 → 囊泡浓缩 → 囊泡纯化 → 缓冲液置换与制剂化 → 质量放行与稳定性评价

其中，浓缩与纯化的目的不同：

         ①浓缩提高单位体积中的颗粒数量，但可能同时浓缩杂质。

         ②纯化降低游离蛋白质、脂蛋白、核酸、培养基成分和其他非囊泡颗粒的含量。

         聚合物沉淀、超滤或切向流过滤可用于浓缩，但不能单独证明获得了高纯度外泌体。

3.2 主要提取纯化技术对比

单一技术通常难以同时获得较高回收率、较高纯度和良好规模化能力。较常见的组合方式为：

         TFF浓缩和洗滤 → SEC或其他层析精制 → 视预期用途和工艺验证结果进行除菌过滤或无菌灌装 → 制剂化 

         组合工艺也不能自动保证原料质量。膜截留范围、层析填料、流速、温度、缓冲液和样品负载量均可能改变囊泡回收率、亚群组成和生物活性。

3.3 外泌体原料需要确认哪些质量属性

         外泌体质量较合理的评价包括四个层面：

         细胞外囊泡的分子特征应通过多类标志物综合评价。通常应同时检测膜相关EV蛋白、EV相关胞质蛋白和可能共同分离的非囊泡成分，以判断样品中是否含有EV并评价其纯度。具体标志物应根据细胞来源和分离方法选择。仅检出CD9、CD63或CD81，不能单独证明样品为外泌体，也不能说明样品具有较高纯度。

         纳米颗粒跟踪分析可以测量一定范围内的颗粒尺寸和浓度，但无法可靠区分外泌体、脂蛋白、病毒样颗粒及蛋白聚集物。颗粒数量较高，可能表示囊泡回收率较高，也可能表示非囊泡颗粒较多。

3.4 制剂稳定性决定使用时是否仍有活性

外泌体膜及其载荷可能受到温度、pH、离子强度、氧化、剪切、冻融和配方成分影响。常见变化包括：

         ① 膜破裂或通透性增加；

         ② 颗粒聚集和粒径增大；

         ③ 表面蛋白构象改变；

         ④ RNA和蛋白质降解；

         ⑤ 囊泡摄取或功能活性下降。

         冻干可以减少对持续低温冷链的依赖，但冻干过程本身可能造成膜损伤和聚集。蔗糖、海藻糖等保护剂可在部分体系中改善复溶后的完整性，但保护效果取决于囊泡来源、缓冲液、冻干程序和残余水分。

         原料液中的稳定性不能代表其进入最终护肤配方后仍然稳定。表面活性剂、高浓度乙醇、防腐剂、香精、极端pH和反复开封均可能影响囊泡结构。功效和稳定性评价宜在最终配方、最终包装及标示储存期限内完成。

4 外泌体作用于皮肤的基本机理

4.1 生物学效应需要完成连续递送过程

外泌体发挥作用可概括为：

         囊泡在配方中保持完整和活性 → 到达皮肤目标区域 → 与靶细胞接触 → 表面分子触发信号或囊泡被摄取 → 有效载荷到达作用部位 → 改变细胞信号、基因表达或代谢 → 产生组织水平变化

         细胞培养实验通常把囊泡直接加入细胞培养液中，囊泡能够直接接触受体细胞。外用护肤品还需要经历储存、涂抹、皮肤表面停留和角质层阻隔，二者的实际暴露剂量存在明显差异。

4.2 外泌体与皮肤细胞的相互作用方式

外泌体可通过以下方式影响角质形成细胞、成纤维细胞、免疫细胞和血管内皮细胞：

① 表面配体与受体结合

         囊泡表面的整合素、四跨膜蛋白、糖蛋白和脂质可与细胞膜受体或蛋白聚糖结合，直接启动细胞信号。此类作用不一定需要内部载荷进入细胞。

② 细胞内吞

         囊泡可经网格蛋白介导内吞、小窝相关内吞、大胞饮或吞噬等方式进入细胞。具体途径取决于囊泡来源、表面组成和受体细胞类型。

③ 胞内运输

         被摄取的囊泡通常先进入内体系统，其中一部分会进入溶酶体并被降解，另一部分可能发生膜融合或内体逃逸。

④ 功能性载荷释放

         部分蛋白质或RNA可进入细胞质并参与生物学过程，但“囊泡被细胞摄取”不等于“囊泡载荷已经有效释放”。定量研究显示，功能性载荷递送效率可能明显低于颗粒摄取率，内体滞留和溶酶体降解是重要限制因素。

miRNA载荷产生转录后调节的理论过程可表示为：

         外泌体摄取 → 内体处理与部分载荷释放 → miRNA进入细胞质 → 装载至Argonaute/RNA诱导沉默复合体 → 与靶mRNA配对 → mRNA降解或翻译抑制 → 靶蛋白表达下降

         只有当囊泡中含有足够数量的功能性miRNA，并且其能够到达受体细胞质时，这一过程才可能产生可测量作用。

4.3 对炎症信号的调节

紫外线、屏障损伤和氧化应激可激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号：

         紫外线、活性氧或炎症受体激活 → IκB激酶活化 → IκB磷酸化和降解 → NF-κB进入细胞核 → 白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等炎症相关基因表达增加

         在部分间充质基质细胞来源细胞外囊泡研究中，囊泡蛋白质、脂质或调节性RNA与NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及巨噬细胞功能变化有关，可能降低过度炎症反应。

         这一作用并非所有外泌体共有。来源细胞受到炎症刺激时，其囊泡也可能增加炎症信号。外泌体是否具有抗炎作用，需要通过具体原料的细胞因子、受体信号和剂量—效应试验进行确认。

4.4 对氧化应激的影响

紫外线照射可增加皮肤细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS），主要包括超氧阴离子自由基（O₂•⁻）、过氧化氢（H₂O₂）和羟自由基（•OH）。其部分基本反应为：

O₂ + e⁻ → O₂•⁻

2 O₂•⁻ + 2 H⁺  —SOD→  H₂O₂ + O₂

2 H₂O₂  —CAT→  2 H₂O + O₂

Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + OH⁻ + •OH

         其中，SOD为超氧化物歧化酶，CAT为过氧化氢酶。活性氧生成超过细胞清除能力时，可引起脂质过氧化、DNA和蛋白质损伤，并促进炎症反应及胶原降解。

 部分来源的细胞外囊泡可在实验模型中调节核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号：

         氧化应激改变Keap1状态 → Nrf2降解减少并进入细胞核 → 结合抗氧化反应元件（ARE） → HO-1、NQO1、GCLC等抗氧化相关基因表达增加

         细胞外囊泡对氧化应激的作用通常主要表现为调节细胞抗氧化防御系统，而不是直接清除自由基。该作用受囊泡来源、载荷组成、剂量和实验条件影响，需要针对具体原料进行验证。

4.5 对成纤维细胞和胶原代谢的影响

         紫外线可通过活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和NF-κB等信号提高基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达。MMP-1可先切割Ⅰ型和Ⅲ型纤维胶原，其他MMP进一步降解胶原片段，导致真皮胶原网络紊乱。

相关过程可表示为：

         紫外线或ROS增加 → AP-1/NF-κB活化 → MMP-1等表达增加 → Ⅰ型和Ⅲ型胶原降解加快 → 真皮基质结构受损

部分细胞外囊泡在成纤维细胞或动物模型中可降低MMP表达，或影响转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）/Smad信号：

         TGF-β与受体结合 → Smad2/3磷酸化 → Smad2/3与Smad4形成复合物 → 进入细胞核 → 调节COL1A1、COL1A2、COL3A1等基因表达 → 胶原合成变化

         囊泡还可能通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt和MAPK/ERK信号影响成纤维细胞存活、增殖和迁移。

         胶原相关基因或蛋白表达升高，不等同于已经形成排列有序、力学性能正常的真皮胶原。评估抗皱作用还需要观察胶原成熟、纤维结构、组织力学和人体皮肤变化。

4.6 对表皮修复和血管生成的影响

特定细胞外囊泡在创伤模型中可能影响：

         ① 角质形成细胞迁移和再上皮化；

         ② 成纤维细胞迁移和基质沉积；

         ③ 巨噬细胞及局部炎症状态；

         ④ 血管内皮生长因子相关信号和新生血管形成；

         ⑤ 创面基质重塑。

其简化过程为：

         囊泡与损伤区细胞作用 → 调节炎症、细胞迁移和血管生成信号 → 再上皮化与肉芽组织形成变化 → 进入基质重塑阶段

         创伤模型缺少完整角质层屏障，囊泡可直接接触活性细胞。创伤愈合研究中的结果不能直接作为完整皮肤外用抗老功效的证据。

5 外泌体能否穿透皮肤屏障

5.1 完整角质层限制囊泡被动渗透

         角质层由角质细胞和细胞间脂质构成，对亲水性大分子和纳米颗粒形成较强屏障。外泌体通常为几十至数百纳米的膜性颗粒，其尺寸明显大于适合经皮被动扩散的小分子。

普通外用后，外泌体可能主要分布于：

         ① 皮肤表面；

         ② 角质层浅部；

         ③ 皮肤纹理和细胞间隙表面；

         ④ 毛囊开口和毛囊上部。

         毛囊可形成纳米颗粒的局部储存区域，但毛囊沉积不等于囊泡已经完整进入活性表皮或真皮。现有研究尚不足以证明普通护肤配方中的完整外泌体能够以稳定、可重复且达到生物效应的剂量穿过人体完整角质层。

5.2 透皮研究容易受到检测方法影响

         不少研究使用脂溶性荧光染料标记囊泡。染料可能从囊泡膜脱离、形成染料聚集体或转移到皮肤脂质中。观察到荧光信号并不能单独证明完整囊泡已经到达相应皮肤深度。

较可靠的透皮研究需要同时确认：

         ① 标记物仍与完整囊泡结合；

         ② 皮肤不同深度中的囊泡结构仍然存在；

         ③ 检测到的不是游离染料或囊泡碎片；

         ④ 到达靶层的数量能够产生生物效应。

5.3 微针和激光会改变产品的使用条件

微针、射频微针和点阵激光可在角质层形成微通道，使外泌体及其他配方成分更容易接触活性表皮或真皮：

         微通道形成 → 角质层屏障减弱 → 外泌体与皮肤活细胞接触增加

         屏障减弱后，产品中的非目标成分也可能进入更深层皮肤。例如，微生物污染、细菌产生的内毒素、培养基残留蛋白以及纯化过程中残留的工艺助剂，均可能增加感染、刺激或异常炎症反应的风险。

         普通外用化妆品通常按照涂抹于完整皮肤的方式进行质量控制和安全评价，其微生物控制、内毒素控制和无菌要求与用于微针、激光术后或其他侵入性操作的制剂不同。因此，标注为外用的外泌体产品不能据此推定适合在微针或激光后导入，也不宜用于明显破损或开放性皮肤。

         微针和激光本身还会启动炎症反应、细胞迁移和胶原重塑。联合使用后观察到的皮肤改善，可能来自操作本身、外泌体制剂或二者的共同作用，不能全部归因于外泌体。

6 安全隐患、法规与使用注意事项

6.1 安全风险主要来自原料和生产过程

外泌体不含完整活细胞，但仍属于具有生物活性的复杂颗粒。主要风险包括：

         ① 来源细胞身份错误、衰老或遗传异常；

         ② 供体相关病原体传播风险；

         ③ 细菌、真菌、支原体或病毒污染；

         ④ 内毒素和培养基残留；

         ⑤ 血清蛋白、抗生素和生长因子残留；

         ⑥ 宿主细胞蛋白及DNA残留；

         ⑦ 聚合物沉淀剂或其他工艺助剂残留；

         ⑧ 批次之间组成和效力变化；

         ⑨ 不符合预期的炎症、免疫或凝血相关作用。

6.2 使用途径改变风险等级

不同使用方式对应不同的组织暴露程度：

         完整皮肤外用 → 屏障受损皮肤使用 → 微针或激光后使用 → 皮内或皮下注射 → 静脉等系统给药

         侵入程度增加后，无菌、内毒素、病毒安全、剂量、生物效力和杂质控制要求相应提高。

         美国食品药品监督管理局（FDA）曾收到严重不良事件报告，涉及患者使用未经批准、宣称含有外泌体的治疗产品。FDA指出，用于疾病治疗等医疗用途的外泌体产品通常按药品或生物制品管理，上市前需经过相应的审评批准。目前，FDA尚未批准任何用于治疗疾病的外泌体产品。

6.3 中国化妆品相关要求

         国家药品监督管理局政务服务门户“化妆品新原料备案”办事指南及常见问题指出，《化妆品安全技术规范》规定为禁用组分的原料不属于化妆品新原料，其中包括人的细胞、组织或人源产品。指南同时指出，具有“激活细胞”“再生细胞”“促愈合作用”等医疗作用的原料，其实际功能超出化妆品定义范围。

         据上述公开规则判断，人源细胞外囊泡具有明确的人源属性，作为普通化妆品原料存在重大的合规障碍。植物或其他非人源囊泡也需要依据实际来源、制备方法、组成、安全性和原料管理状态进行评价，不能由“非人源”直接推定其符合化妆品使用要求。

7 外泌体制备、质量评价与作用机制研究相关代表性试剂和材料

表1 外泌体分离纯化、缓冲与制剂稳定相关产品

         本组产品涵盖细胞外囊泡的沉淀富集、密度梯度纯化、缓冲液配制、冻融保护、冻干赋形和制剂稳定性研究。相关应用需结合外泌体来源、分离工艺和后续检测方法进行条件筛选。

表2 外泌体荧光示踪与氧化应激检测相关产品

         本组产品用于囊泡膜标记、细胞与囊泡示踪、细胞摄取观察以及活性氧相关作用机理验证。荧光示踪实验需设置游离染料、染料聚集物和未标记样品对照，避免将染料转移误判为完整囊泡递送。

表3 外泌体生成、释放、摄取与胞内运输研究相关产品

         本组产品主要用于干预神经酰胺代谢、细胞骨架、胆固醇依赖性膜结构、网格蛋白内吞、大胞饮、动力蛋白以及内体—溶酶体运输。化学抑制剂可能同时影响多种细胞过程，实验中宜结合细胞活力、遗传学干预和多种摄取检测方法进行验证。

表4 皮肤炎症、修复与细胞外基质作用机理研究相关产品

         本组产品用于验证外泌体是否通过转化生长因子β、磷脂酰肌醇3-激酶、核因子κB及基质金属蛋白酶等信号影响炎症反应、细胞迁移、胶原代谢和皮肤修复。

         注：以上为阿拉丁代表性科研及配方研究相关产品，更多产品规格、级别、COA信息可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。

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