从 DENV-2 筛选命中到四血清型覆盖：JNJ-1802 的泛血清型构效关系优化
从 DENV-2 筛选命中到四血清型覆盖：JNJ-1802 的泛血清型构效关系优化
引言
登革病毒（dengue virus，DENV）主要包括 DENV-1、DENV-2、DENV-3 和 DENV-4 四种血清型。四种血清型都能够引起登革病毒感染，但病毒蛋白序列并不完全相同，同一小分子对不同血清型的抑制活性也可能存在明显差异。因此，面向登革热开发直接抗病毒药物，需要关注化合物能否同时覆盖四种血清型。
JNJ-1802 来源于一类 3-酰基吲哚（3-acyl-indole）抑制剂。2018 年，研究者从 DENV-2 表型抗病毒筛选中发现这一化学系列，并通过构效关系研究提高抗病毒活性，同时逐步获得对其他血清型的抑制作用。优化过程中还改善了理化性质和代谢稳定性，并发现两个对映体之间存在明显的抗病毒活性差异。[1]
后续研究将评价范围进一步扩展到四种血清型、不同病毒基因型、手性稳定性以及口服药代性质。2024 年报道的 JNJ-1802 对四种代表性 DENV 血清型的半数最大效应浓度（EC₅₀）达到 0.057–11 nM，并具有临床前物种口服生物利用度、人肝细胞低清除率和体内抗病毒活性。[2,3]
JNJ-1802 的优化围绕一个明确的问题展开：如何使同一个分子在具有遗传差异的 DENV 病毒中保持较高抗病毒活性，同时满足构型稳定性、体内暴露和安全性等候选药物要求。
本文主要缩写与符号
缩写或符号 | 全称或含义 | 本文含义 |
DENV | 登革病毒（dengue virus） | 本文研究的病毒 |
DENV-1～DENV-4 | 登革病毒四种主要血清型 | 用于评价药物的泛血清型覆盖 |
JNJ-1802 | 化合物研发代码 | 本文讨论的泛血清型小分子抑制剂 |
SAR | 构效关系（structure–activity relationship） | 分子结构变化与活性、稳定性等性质之间的关系 |
EC₅₀ | 半数最大效应浓度 | 达到 50% 抗病毒效应所需浓度；同一实验体系下通常数值越低表示活性越强 |
NS3 | 非结构蛋白 3（nonstructural protein 3） | 具有蛋白酶和解旋酶等功能，参与病毒蛋白加工和 RNA 复制 |
NS4B | 非结构蛋白 4B（nonstructural protein 4B） | 与病毒膜性复制结构形成相关，是该系列抑制剂作用相关的关键蛋白 |
V91A 等 | 氨基酸突变表示法 | 如 V91A 表示第 91 位缬氨酸（V）变为丙氨酸（A） |
1. 从 DENV-2 命中到四血清型活性评价
1.1 DENV-2 表型筛选建立化学起点
该系列最初来自 DENV-2 表型抗病毒筛选。表型筛选直接测量化合物能否抑制细胞中的病毒复制，并不要求预先知道具体分子靶点。
早期结构优化首先围绕 DENV-2 展开。随着其他三种血清型的数据加入，研究者发现同一化合物在四种血清型上的活性并不完全一致。[1]
构效关系评价因此需要同时观察：
DENV-1 EC₅₀｜DENV-2 EC₅₀｜DENV-3 EC₅₀｜DENV-4 EC₅₀
对于泛血清型候选物，四个 EC₅₀ 都需要保持在足够低的范围。其中相对低敏感血清型的 EC₅₀ 决定了整个分子的覆盖下限。
1.2 四种血清型的活性逐渐进入低纳摩尔范围
2023 年报道的化合物 24a 对四种血清型的 EC₅₀ 范围为 1.1–240 nM，28a 为 0.60–84 nM，同时表现出改善的手性稳定性和临床前物种口服生物利用度。[2]
2024 年 JNJ-1802 对四种代表性血清型的 EC₅₀ 范围达到 0.057–11 nM。[3]
不同研究采用的病毒株和检测体系并不完全相同，因此跨论文数据不适合直接计算活性提高倍数。各阶段数据共同说明，后期优化使不同血清型所需的有效浓度整体进入更低范围。
泛血清型构效关系因此关注的是四种血清型组成的整体活性分布，以及相对低敏感血清型能否同时保持较高抑制活性。
2. NS4B 与病毒复制复合体组装
2.1 NS3 和 NS4B 参与病毒 RNA 复制
DENV 的 RNA 基因组翻译形成多聚蛋白，随后被切割为多个成熟病毒蛋白。其中 NS3 和 NS4B 都是不进入成熟病毒颗粒、但参与病毒复制的非结构蛋白。
NS3 的 N 端在 NS2B 辅助下构成丝氨酸蛋白酶，C 端具有核苷三磷酸酶和 RNA 解旋酶等功能。NS4B 是高度疏水的膜相关蛋白，与内质网膜重塑和病毒 RNA 复制结构形成有关。NS4B 成熟之前还会存在于 NS4A-2K-NS4B 前体中，其中 2K 是连接 NS4A 与 NS4B 的短肽片段。
对同系列化合物 JNJ-A07 的研究首先发现，这类抑制剂能够阻断 NS3 与 NS4B 相关蛋白之间的相互作用，并抑制病毒复制复合体形成。[4]
JNJ-1802 随后的实验得到相同方向的结果。在表达 NS4A-2K-NS4B 前体和 NS2B–NS3 蛋白酶—解旋酶复合体的细胞体系中，JNJ-1802 能够降低 NS3 与 NS4B 相关复合体的形成。[5]
2.2 JNJ-1802 主要影响新的复合体形成
时间依赖实验进一步显示，JNJ-1802 能够阻止新的 NS3–NS4B 相关复合体形成；当相关复合体已经建立后再加入药物，原有复合体不会被明显拆解。[5]
这一结果将 JNJ-1802 的作用与病毒复制复合体的组装阶段联系起来。
同时，NS4B 耐药突变能够明显降低病毒对 JNJ-1802 的敏感性。原研究中，V91A、L94F、T108I 等主要耐药突变均定位于 NS4B，并且相关突变也会提高阻断 NS3–NS4B 相互作用所需的药物浓度。
原始研究 Figure 1 将这些证据集中展示在同一张图中：从 JNJ-1802 的化学结构，到多血清型、多基因型病毒的体外活性，再到 NS4B 耐药突变和 NS3–NS4B 相互作用实验，可以看到“分子结构—病毒遗传差异—NS4B 药物敏感性”之间的联系。
图1 JNJ-1802 的化学结构、跨基因型/跨血清型体外抗病毒活性及 NS4B 相关作用机制。
（a）JNJ-1802 的化学结构；（b）JNJ-1802 在 Vero E6 细胞中对覆盖 DENV-1～DENV-4 不同基因型临床分离株的体外抗病毒活性；（c）DENV NS4B 的膜拓扑及 JNJ-1802 耐药选择得到的主要 NS4B 突变位置；（d）JNJ-1802 对野生型及耐药突变型 NS3–NS4B 相互作用的浓度依赖性抑制。
图片来源： 原图引自 Goethals O, Kaptein SJF, Kesteleyn B, et al. Blocking NS3–NS4B interaction inhibits dengue virus in non-human primates. Nature. 2023;615:678–686. DOI: 10.1038/s41586-023-05790-6，Figure 1。原论文采用 Creative Commons Attribution 4.0 International License（CC BY 4.0）
Figure 1 同时说明了现阶段机制解释的证据边界。2023 年研究能够确定 JNJ-1802 阻断 NS3–NS4B 相关复合体形成，并能够通过 NS4B 耐药突变改变药物敏感性，但当时仍不能确定 JNJ-1802 与 NS4B 的具体原子级结合姿态。[5] 因此，后续构效关系可以确定某种结构改造是否改善活性，却不能在缺少高分辨率复合物结构的情况下，为每一个取代基指定具体的 NS4B 氨基酸相互作用。
3. JNJ-1802 三个结构区域的构效关系优化
JNJ-1802 具有一个明确的手性中心，并以 (2S) 构型作为开发候选物。其结构可以分为三个主要 SAR 区域：
① 甲氧基/甲基砜取代的苯胺片段
② 与手性中心连接的 4-氯-2-甲氧基苯基片段
③ 5-三氟甲氧基取代的吲哚片段
最终结构来自这些区域的连续取代扫描以及完整分子的抗病毒、代谢和药代数据。
3.1 苯胺片段：极性与代谢性质的调节
早期 3-酰基吲哚系列已经具有较高抗病毒活性，但细胞活性并不能保证口服给药后获得适宜暴露。因此，苯胺区域成为调节分子极性和代谢性质的重要位置。
研究者考察了不同极性侧链及砜类取代，最终 JNJ-1802 保留了甲氧基和甲基砜取代的苯胺片段。[3]
甲基砜会改变这一局部结构的极性和氢键受体特征，并进一步影响整个分子的理化与代谢性质。最终候选物的实验数据表明，这一结构与其他两个区域组合后，能够同时维持高抗病毒活性，并获得临床前物种口服生物利用度和人肝细胞低清除率。[3]
苯胺片段的优化同时受到抗病毒效力、分子极性、代谢稳定性和体内暴露的约束。
3.2 手性芳基：构型稳定性进入候选物评价
3-酰基吲哚系列的中央碳原子可以形成两个对映体。2018 年研究对外消旋化合物进行手性色谱分离后发现，两个对映体的抗病毒活性存在明显差异。[1]
这说明手性中心周围的三维排列会影响有效分子识别。后续优化因此不仅需要选择高活性对映体，还需要保证其构型具有足够稳定性。
2023 年的研究已经将手性稳定性与泛血清型活性和口服生物利用度共同作为先导优化指标。[2]
JNJ-1802 最终在这一位置采用 4-氯-2-甲氧基苯基，并选择单一 (2S) 构型。
当两个对映体的抗病毒活性不同，活性构型发生消旋会改变真正高活性分子所占的比例。因此，手性稳定性会影响高活性对映体有效暴露的维持。
3.3 吲哚 5 位取代：提高泛血清型效力
吲哚芳环是该系列另一个重要 SAR 区域。研究者考察了不同卤素、烷基和烷氧基取代，JNJ-1802 最终采用5-三氟甲氧基（5-OCF₃）取代的吲哚。
含有这一最终结构组合的 JNJ-1802 对四种代表性 DENV 血清型达到 0.057–11 nM 的 EC₅₀ 范围。[3]
OCF₃ 会同时改变芳环电子性质、疏水性和空间体积，这些因素都可能影响分子构象、靶蛋白识别和代谢行为。由于缺少 JNJ-1802–NS4B 原子分辨率复合物结构，目前能够确定的是实验构效关系：5-OCF₃ 出现在最终实现高水平泛血清型活性的结构组合中，而其具体原子级作用方式仍需进一步结构研究。
经过苯胺、手性芳基和吲哚三个区域的连续优化，最终分子同时获得了较高的泛血清型抗病毒活性、构型稳定性和适宜的药代性质。
4. 从四种血清型扩展到病毒遗传多样性和体内药效
4.1 同一血清型内部仍存在基因型差异
DENV-1～DENV-4 是四种主要血清型，每一种血清型内部还包含多个基因型和天然病毒株。
JNJ-1802 在覆盖四种血清型不同基因型的 20 株 DENV 中进行了进一步测试。大部分病毒株的平均 EC₅₀ 位于 <0.04–1.8 nM，而其中一株 DENV-4 genotype 3 Thailand 病毒的平均 EC₅₀ 为 45 nM。
因此，泛血清型评价可以逐级扩展为：
DENV-2 筛选株 → 四种血清型代表株 → 多血清型、多基因型病毒株
第一层适合快速 SAR 筛选；第二层用于判断四种血清型之间是否存在明显活性短板；第三层用于检验小分子对天然病毒遗传差异的耐受程度。
DENV-4 genotype 3 Thailand 株表现出的相对较低敏感性也说明，泛血清型并不表示所有天然病毒株对药物具有完全相同的敏感性。更准确的评价依据是不同病毒株 EC₅₀ 的整体分布及其范围。
4.2 四血清型体外活性进一步转化为小鼠体内药效
体外活性需要进一步经过体内暴露和药效验证。
原研究首先在 DENV-2 AG129 小鼠模型中观察到 JNJ-1802 随剂量增加降低病毒 RNA，并在致死性感染模型中改善生存率。研究随后进一步扩展到 DENV-1、DENV-3 和 DENV-4。
在预防性给药设计下，DENV-1、DENV-3 或 DENV-4 感染的 AG129 小鼠接受 JNJ-1802 后，病毒 RNA 水平明显降低，在 DENV-1、DENV-3 和 DENV-4 感染模型中，60 和 6 mg/kg/day 两个预防性给药组均表现出明显的生存获益。原论文据此认为，这些结果将体外泛血清型数据进一步延伸到了四种血清型的小鼠体内模型。
Figure 2 展示了这一层验证：四种血清型的体外覆盖不仅体现在 EC₅₀ 数据上，还能够在不同 DENV 感染小鼠模型中转化为病毒血症降低和生存改善。
图2 JNJ-1802 在 AG129 小鼠中的四血清型体内抗病毒作用。
（a、b）DENV-2 病毒血症实验设计及不同 JNJ-1802 剂量对感染后第 3 天病毒 RNA 水平的影响；（c、d）DENV-2 致死性感染模型设计及不同剂量对小鼠生存率的影响；该模型在感染前给予抗黄病毒 4G2 抗体以诱导抗体依赖性增强。；（e）DENV-1、DENV-3 和 DENV-4 病毒血症/生存实验设计；（f–h）JNJ-1802 对三种血清型感染小鼠生存率的影响；（i–k）感染后第 3 天病毒 RNA 水平。
图片来源： 原图引自 Goethals O, Kaptein SJF, Kesteleyn B, et al. Blocking NS3–NS4B interaction inhibits dengue virus in non-human primates. Nature. 2023;615:678–686. DOI: 10.1038/s41586-023-05790-6，Figure 2。原论文采用 CC BY 4.0 许可。原论文图注注明 Figure 2a、2c 和 2e 的实验示意图改编自Kaptein 等 2021 年的前期研究（本文参考文献[4]）。
Figure 2 主要证明的是小鼠中的四血清型体内药效。原研究还另外进行了治疗性 DENV-2 小鼠实验：即使在感染后第 4 天或第 5 天才开始给药，病毒 RNA 仍可明显下降。[5]
5. 耐药突变揭示 NS4B 序列与药物敏感性的关系
不同基因型反映自然界已经存在的病毒序列差异；耐药选择实验则可以观察病毒在持续药物压力下能够通过哪些突变降低药物敏感性。
在两个独立的 DENV-2 耐药选择实验中，第一个持续出现的 NS4B 突变为 V91A，即第 91 位缬氨酸（Val，V）变为丙氨酸（Ala，A）。随着药物压力继续增加，还出现 S85L、L94F 和 T108I 等突变。[5]
将这些突变分别导入病毒复制实验体系后：
①V91A 使 JNJ-1802 活性降低约 180 倍；
②L94F 使活性降低约 520 倍；
③T108I 使活性降低约 12 倍；
④V91A/L94F/T108I 三突变组合使活性降低约 4200 倍。
这些结果建立了 NS4B 序列变化与 JNJ-1802 药物敏感性变化之间的联系。
耐药形成所需时间同样提供了信息。V91A 大约从第 20 周开始持续出现，病毒需要继续积累其他 NS4B 突变，经过 40 周以上培养，才能在 1.29 μM JNJ-1802 条件下稳定生长；这一浓度超过原始病毒 EC₅₀ 的 20,000 倍。
原研究因此将 JNJ-1802 评价为具有较高的遗传耐药屏障。[5]
对泛血清型候选物而言，高基础活性的意义还在于提供一定的活性余量：当某些天然多态性或耐药突变使病毒敏感性下降时，起始 EC₅₀ 越低，分子仍然保持有效抑制的空间通常越大。
6. 候选物选择同时取决于抗病毒覆盖和成药性质
JNJ-1802 的候选物选择建立在多个实验维度之上。
2024 年 Journal of Medicinal Chemistry 报道的主要性质包括：
①对四种代表性 DENV 血清型具有 0.057–11 nM 的 EC₅₀；
②在多个临床前物种中具有口服生物利用度；
③在人肝细胞中表现出低清除率；
④体外安全药理评价未出现主要警示；
⑤在 DENV-2 小鼠感染模型中表现出随剂量增加而增强的抗病毒药效。[3]
2023 年 Nature 研究还指出，同系列 JNJ-A07 已具有很高的泛血清型抗病毒活性，但 JNJ-1802 因具有改善的临床前安全性特征而被优先选择进入临床开发。
这说明，当体外抗病毒活性已经进入低纳摩尔甚至皮摩尔范围后，候选物评价会进一步受到代谢稳定性、口服暴露、构型稳定性和安全性共同约束。
7. 泛血清型构效关系优化的核心
JNJ-1802 的研究显示，针对具有遗传多样性的病毒开展小分子优化时，构效关系需要覆盖三个层次。
第一层是化学结构与单株病毒活性。
这一层用于确定先导结构、发现允许修饰的分子区域，并提高基础抗病毒效力。
第二层是化学结构与病毒遗传多样性的关系。
同一化合物需要逐渐从单一筛选株扩展至四种血清型，再进一步进入不同基因型和天然病毒株。不同病毒株 EC₅₀ 的分布能够反映一种结构对病毒天然序列变化的适应范围。
第三层是抗病毒覆盖与成药性质的结合。
当活性达到较高水平后，手性稳定性、代谢清除、口服暴露、体内药效和安全性共同决定一个分子是否能够成为开发候选物。
JNJ-1802 从 DENV-2 表型筛选中的 3-酰基吲哚先导结构，最终发展为能够覆盖四种 DENV 血清型和多个基因型的候选物，其核心在于将评价范围从单个病毒株的活性扩展到病毒遗传多样性背景下的活性分布，再进一步验证这种覆盖能否在体内保持，并与可开发的药代和安全性质相结合。
这一思路也适用于其他具有明显天然序列变异的抗病毒药物项目：候选分子的稳定有效性不仅取决于某一个实验株上的最低 EC₅₀，还取决于它能够覆盖多大的病毒遗传空间，以及面对天然变异和耐药突变时能够保留多大的抗病毒活性余量。
8. JNJ-1802 泛血清型构效关系优化与关键合成研究相关代表化学品
表1. 核心抑制剂及构效关系研究相关砌块
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
对映体机制研究对照化合物 | 2135640-92-3 | (-)-JNJ-A07 | ≥99% | JNJ-A07 低活性对映体研究对照，可用于比较手性构型对登革病毒抗病毒活性及 NS4B 相关作用的影响 | |
泛血清型登革病毒抑制剂研究化合物 | 2135640-93-4 | (+)-JNJ-A07 | ≥98% | JNJ-1802 同系列代表性抑制剂，用于登革病毒泛血清型活性、NS3–NS4B 相互作用及复制复合体形成机制研究 | |
吲哚母核对照砌块 | 120-72-9 | 吲哚 | ≥99% | 3-酰基吲哚类抗登革病毒化合物的基础杂环母核，可用于吲哚取代效应及构效关系研究 | |
吲哚 5 位卤素取代砌块 | 399-52-0 | 5-氟吲哚 | ≥98% | 用于考察吲哚 5 位氟取代对抗病毒效力、电子性质及代谢稳定性的影响 | |
吲哚 5 位卤素取代砌块 | 17422-32-1 | 5-氯吲哚 | ≥98% | 用于吲哚 5 位氯取代系列构效关系研究，可比较卤素体积和电子效应对活性的影响 | |
吲哚 5 位烷基取代砌块 | 614-96-0 | 5-甲基吲哚 | ≥99% | 用于考察吲哚 5 位小烷基取代对疏水性、空间占据和抗病毒活性的影响 | |
吲哚 5 位烷氧基取代砌块 | 1006-94-6 | 5-甲氧基吲哚 | ≥99% | 用于比较吲哚 5 位烷氧基取代的电子和极性效应，适用于 3-酰基吲哚系列构效关系研究 | |
JNJ-1802 关键吲哚砌块 | 262593-63-5 | 5-三氟甲氧基吲哚 | ≥97% | 对应 JNJ-1802 的 5-三氟甲氧基吲哚片段，可用于泛血清型活性相关结构优化及目标化合物合成 | |
芳基取代基础对照砌块 | 93-25-4 | 2-甲氧基苯乙酸 | ≥99% | 用作手性芳基区域基础结构对照，可用于研究邻位甲氧基及后续对位取代对构型稳定性和活性的影响 | |
芳基卤素取代构效关系砌块 | 886498-61-9 | 2-(4-氟-2-甲氧基苯基)乙酸 | ≥98% | 用于 4-氟-2-甲氧基芳基系列合成，可研究对位氟取代对泛血清型活性和代谢性质的影响 | |
JNJ-1802 关键芳基前体 | 170737-95-8 | 2-(4-氯-2-甲氧基苯基)乙酸 | ≥97% | 对应 JNJ-1802 的 4-氯-2-甲氧基苯基区域，可作为关键芳基酰基前体用于目标骨架构建及芳基取代研究 | |
JNJ-1802 关键苯胺砌块 | 62606-02-4 | 3-Methanesulfonyl-5-methoxyaniline | ≥98% | 对应 JNJ-1802 的甲氧基/甲基砜取代苯胺片段，用于调节抗病毒活性、分子极性及代谢性质相关研究 |
表2. JNJ-1802 关键合成与官能团转化试剂
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
酰氯制备试剂 | 7719-09-7 | 氯化亚砜 | 试剂级, 高级纯, ≥99.5%, low iron | 用于芳基乙酸向相应酰氯的转化，可服务于 3-酰基吲哚骨架构建中的酰基前体制备 | |
亲核取代反应用碱 | 7087-68-5 | N,N-二异丙基乙胺 | 精馏级, ≥99.5% | 位阻型有机碱，可用于 α-卤代羰基中间体与取代苯胺的亲核取代及反应体系酸捕获 | |
吲哚酰化活化试剂 | 96-10-6 | 一氯二乙基铝 | 1.0 M in hexanes | 路易斯酸活化试剂，可促进取代吲哚的 3 位 Friedel–Crafts 酰化，构建 3-酰基吲哚核心骨架 | |
α-溴化试剂 | 4207-56-1 | 苯基三甲基三溴化铵 | ≥97% | 温和溴化试剂，可用于 3-酰基吲哚侧链 α 位溴化，为后续取代苯胺亲核取代提供反应位点 |
注：以上为阿拉丁代表性科研相关产品，具体用途应结合产品规格、批次COA及目标反应或评价体系确定。更多产品规格、级别和COA信息可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。
参考文献
[1] Bardiot, D.; Koukni, M.; Smets, W.; et al. Discovery of Indole Derivatives as Novel and Potent Dengue Virus Inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry, 2018, 61(18), 8390–8401. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.8b00913.
[2] Kesteleyn, B.; et al. Discovery of Acyl-Indole Derivatives as Pan-Serotype Dengue Virus NS4B Inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry, 2023, 66(13), 8808–8821. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c00403.
[3] Kesteleyn, B.; Bonfanti, J.-F.; Bardiot, D.; et al. Discovery of JNJ-1802, a First-in-Class Pan-Serotype Dengue Virus NS4B Inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry, 2024, 67(5), 4063–4082. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.3c02336.
[4] Kaptein, S. J. F.; Goethals, O.; Kiemel, D.; et al. A Pan-Serotype Dengue Virus Inhibitor Targeting the NS3–NS4B Interaction. Nature, 2021, 598, 504–509. DOI: 10.1038/s41586-021-03990-6.
[5] Goethals, O.; Kaptein, S. J. F.; Kesteleyn, B.; et al. Blocking NS3–NS4B Interaction Inhibits Dengue Virus in Non-Human Primates. Nature, 2023, 615, 678–686. DOI: 10.1038/s41586-023-05790-6.
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