非小细胞肺癌具有显著的组织学和分子异质性。EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、RET、MET和HER2等异常可持续激活肿瘤细胞增殖与存活信号，并形成具有不同生物学特征和药物敏感性的分子亚型。

        关键词：非小细胞肺癌；分子分型；EGFR；ALK；ROS1；KRAS；BRAF；RET；MET；HER2；PIK3CA；免疫检查点；靶向治疗；耐药机制

1 非小细胞肺癌的病理类型与分子特征

1.1 主要病理类型

        非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%，主要包括肺腺癌、肺鳞状细胞癌和大细胞癌。肺腺癌中较常见受体酪氨酸激酶突变、基因融合和RAS–MAPK通路异常；肺鳞状细胞癌则更常见TP53异常、细胞周期失调和染色体拷贝数改变。

1.2 驱动基因异常

        驱动基因异常可使肿瘤细胞在缺少正常外源刺激的情况下持续激活增殖和存活信号。NSCLC中具有代表性的驱动异常包括EGFR突变、ALK和ROS1融合、KRAS和BRAF突变、RET融合、MET外显子14跳跃以及HER2突变。不同驱动异常通常形成相对独立的分子亚型，但在肿瘤演化或靶向治疗压力下，也可能出现共突变和耐药亚克隆。

1.3 分子异常的主要形式

        NSCLC中的分子异常可表现为点突变、短片段插入或缺失、外显子跳跃、基因融合和基因扩增。点突变和插入缺失可改变蛋白构象或激酶活性；外显子跳跃可影响受体稳定性；基因融合可通过异常二聚化引起激酶持续激活；基因扩增则可增加靶蛋白表达和信号输出。不同异常形式对应不同的检测方法和药物敏感性，不能仅根据基因名称判断其研究意义。

表1 NSCLC主要分子异常及其作用特征

2 EGFR突变及靶向干预

2.1 EGFR信号激活

        表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）属于ErbB受体酪氨酸激酶家族。配体与EGFR胞外结构域结合后，受体形成同源或异源二聚体，激活胞内酪氨酸激酶结构域并发生自磷酸化，进而启动RAS–RAF–MEK–ERK、PI3K–AKT–mTOR和JAK–STAT等信号通路，调节细胞增殖、存活和分化。

2.2 EGFR常见突变

        EGFR外显子19缺失和外显子21 L858R是NSCLC中最常见的经典敏感突变，可增强激酶活性，使肿瘤细胞对EGFR信号形成依赖。EGFR外显子20插入、G719X、L861Q和S768I等异常则具有不同的结构特征和药物敏感性，因此研究中应明确具体突变位点，避免将所有EGFR突变作为同一类型处理。

2.3 EGFR酪氨酸激酶抑制剂

（1）第一代EGFR抑制剂

        吉非替尼和厄洛替尼可逆占据EGFR激酶结构域的ATP结合位点，抑制受体磷酸化及下游信号。两者对EGFR外显子19缺失和L858R突变具有较高活性，但治疗后容易出现获得性耐药。

（2）第二代EGFR抑制剂

        阿法替尼和达可替尼可与EGFR、HER2和HER4形成不可逆共价结合，对多种ErbB家族信号产生抑制作用。第二代抑制剂对经典EGFR敏感突变具有活性，但对部分耐药突变的选择性和耐受性仍存在限制。

（3）第三代EGFR抑制剂

        奥希替尼可选择性抑制EGFR经典敏感突变和T790M耐药突变，并具有较好的中枢神经系统活性。与早期药物相比，第三代抑制剂对野生型EGFR的抑制相对较弱，但治疗后仍可能出现新的靶点内突变和旁路耐药机制。

2.4 EGFR获得性耐药

（1）靶点内突变

        第一代和第二代EGFR抑制剂治疗后可出现T790M突变，该突变可改变ATP结合位点附近的结构并降低药物抑制效果。奥希替尼治疗后则可能出现C797S等异常，破坏药物与EGFR形成共价结合。

（2）旁路信号激活

        MET扩增、HER2扩增、ALK或RET融合以及AXL信号增强，可在EGFR受到抑制后重新激活PI3K–AKT或MAPK通路，使肿瘤细胞减少对EGFR信号的依赖。

（3）下游通路异常

        KRAS、BRAF和PIK3CA突变可直接激活MAPK或PI3K–AKT通路，使下游增殖和存活信号在EGFR受到抑制后继续维持。

（4）组织学与表型转化

        部分EGFR突变型肺腺癌可转化为小细胞肺癌或肺鳞状细胞癌，也可发生上皮–间质转化。组织学转化通常需要通过进展后组织活检确认，单纯液体活检难以完整反映细胞谱系变化。

3 ALK融合及靶向干预

3.1 ALK融合蛋白的形成

        间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）属于受体酪氨酸激酶家族。NSCLC中最常见的异常为2号染色体倒位形成的EML4–ALK融合，融合蛋白保留ALK激酶结构域，并由EML4等融合伴侣提供寡聚化能力，从而在缺少配体的情况下持续激活ALK及其下游信号。

图1 EML4–ALK融合蛋白形成及下游信号激活机制

3.2 ALK下游信号

        ALK融合蛋白可激活RAS–MAPK、PI3K–AKT和JAK–STAT通路，促进肿瘤细胞增殖、存活和迁移。ALK融合与EGFR或KRAS经典驱动突变通常相对互斥，但少数初始肿瘤或治疗后耐药亚克隆中仍可能出现共存异常。

3.3 ALK抑制剂

        Crizotinib可抑制ALK、ROS1和MET，但其应用容易受到中枢神经系统暴露不足和获得性耐药限制。Ceritinib、Alectinib和Brigatinib具有更强的ALK抑制活性及不同程度的脑组织穿透能力，Lorlatinib则可覆盖多种ALK激酶结构域耐药突变。不同ALK抑制剂在突变覆盖范围和中枢神经系统活性方面存在差异。

3.4 ALK耐药机制

        ALK抑制剂耐药可由L1196M、G1202R等激酶结构域突变介导，也可由ALK基因扩增、EGFR或MET旁路信号激活以及下游通路重新启动引起。连续使用不同ALK抑制剂后，还可能形成多个突变位于同一ALK等位基因上的复合突变，进一步增加药物选择难度。

4 ROS1融合及靶向干预

4.1 ROS1融合蛋白

        ROS1是一种受体酪氨酸激酶。NSCLC中的ROS1异常主要表现为基因融合，常见融合伴侣包括CD74、SLC34A2、EZR、SDC4和TPM3。融合蛋白保留ROS1激酶结构域，并由融合伴侣提供二聚化能力，不同融合伴侣还可能影响蛋白的亚细胞定位、稳定性和信号强度。

4.2 ROS1下游信号

        ROS1融合可持续激活RAS–MAPK、PI3K–AKT和JAK–STAT通路，促进肿瘤细胞增殖、存活和迁移。由于ROS1融合可形成较明确的致癌依赖，ROS1融合阳性NSCLC通常被视为相对独立的分子亚型。

4.3 ROS1抑制剂

        Crizotinib可抑制ROS1融合激酶，并用于ROS1信号和药物敏感性研究。Ceritinib、Entrectinib及其他新一代ROS1抑制剂在激酶选择性、中枢神经系统活性和耐药突变覆盖范围方面具有不同特点。

4.4 ROS1耐药机制

        ROS1 G2032R是具有代表性的溶剂前沿突变，可改变药物结合口袋并降低多种早期ROS1抑制剂的结合能力。其他耐药机制还包括D2033N、L2026M等激酶结构域突变、ROS1扩增、旁路受体激活以及下游MAPK信号恢复。

5 KRAS与BRAF突变

5.1 KRAS信号激活

        KRAS是受体酪氨酸激酶下游的小GTP酶，正常情况下在GTP结合活化态和GDP结合失活态之间循环。致癌突变可降低KRAS的GTP水解能力，使其持续处于活化状态，并激活RAF–MEK–ERK、PI3K–AKT和RalGEF–Ral等下游通路。

5.2 KRAS G12C突变

        KRAS G12C是NSCLC中较常见的KRAS突变类型，该突变在第12位引入半胱氨酸残基，为共价小分子抑制剂提供结合位点。Sotorasib和Adagrasib可结合KRAS G12C的Switch II口袋，将蛋白稳定在GDP结合状态；治疗后则可能出现KRAS二级突变、基因扩增、受体酪氨酸激酶反馈激活或MAPK通路再激活。

5.3 BRAF突变

        BRAF是RAS下游的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其突变可持续激活MEK–ERK信号并促进肿瘤细胞增殖。BRAF V600E具有较强的RAS非依赖性单体激酶活性，而非V600突变可表现为激酶二聚化、激酶活性降低或RAS依赖性信号，因此不同类型的BRAF突变需要分别评价。

5.4 BRAF靶向干预

        Dabrafenib和Vemurafenib可抑制BRAF V600突变蛋白。单独抑制BRAF可能引起MAPK通路反馈恢复，因此BRAF抑制剂常与MEK抑制剂联合，用于进一步降低ERK磷酸化和延缓通路再激活。

6 RET、MET、HER2与PIK3CA异常

6.1 RET融合

        RET属于受体酪氨酸激酶，NSCLC中常见KIF5B–RET和CCDC6–RET融合。融合伴侣介导RET激酶结构域异常二聚化，并持续激活MAPK、PI3K–AKT和JAK–STAT信号。Vandetanib和Cabozantinib属于多靶点抑制剂，选择性RET抑制剂则可更直接地阻断RET融合信号，并减少对其他激酶的非选择性抑制。

6.2 MET异常

        MET与肝细胞生长因子结合后，可激活MAPK、PI3K–AKT、STAT和SRC–FAK通路，促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和上皮–间质转化。MET外显子14跳跃可减少受体泛素化和降解，使MET信号持续时间延长；MET扩增则通过增加基因拷贝数和蛋白表达增强信号。两种异常具有不同的形成机制和检测标准，应分别评价。

6.3 HER2异常

        HER2属于ErbB受体家族，可与EGFR、HER3或HER4形成二聚体并激活MAPK和PI3K–AKT通路。NSCLC中的HER2异常包括激酶结构域突变、基因扩增和蛋白过表达，其中外显子20插入是较常见的HER2突变形式。HER2扩增还可能参与EGFR抑制剂获得性耐药，但HER2突变、扩增和过表达属于不同生物标志物，不能相互替代。

6.4 PIK3CA突变

        PIK3CA编码ⅠA类磷脂酰肌醇3-激酶的p110α催化亚基，激活性突变可增加磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸生成，并增强AKT–mTOR信号。在NSCLC中，PIK3CA突变可与其他驱动异常共存，也可参与EGFR抑制剂旁路耐药，研究中应结合共突变背景、AKT和mTOR磷酸化状态以及通路反馈变化评价其作用。

7 免疫检查点与NSCLC免疫逃逸

7.1 PD-1与PD-L1

        程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）主要表达于活化或功能耗竭的T细胞，PD-L1则可表达于肿瘤细胞和多类免疫细胞。PD-1与PD-L1结合后，可抑制T细胞受体和共刺激信号，降低T细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒性，从而促进肿瘤免疫逃逸。

7.2 CTLA-4

        细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）可与CD28竞争结合抗原呈递细胞表面的CD80和CD86，从而限制T细胞早期活化。阻断CTLA-4可增强T细胞启动和克隆扩增，但也可能增加免疫相关不良反应。

7.3 免疫检查点抑制剂

        PD-1抑制剂包括Pembrolizumab、Nivolumab和Cemiplimab，PD-L1抑制剂包括Atezolizumab、Durvalumab和Avelumab，CTLA-4抑制剂包括Ipilimumab。PD-L1表达可用于免疫治疗分层，但不能单独完整预测疗效，驱动基因状态、肿瘤突变负荷、抗原呈递能力和免疫微环境均可能影响治疗反应。

8 NSCLC靶向治疗耐药机制与实验评价

8.1 耐药机制分类

        NSCLC靶向治疗耐药主要包括靶点内突变、靶点或旁路基因扩增、替代受体激活、下游信号恢复、组织学转化和药物组织分布不足。不同耐药机制可同时存在于不同肿瘤病灶或不同亚克隆中，因此单一病灶和单一时间点的检测结果可能无法反映完整的肿瘤异质性。

表2 NSCLC靶向治疗的主要耐药机制

8.2 分子检测

（1）DNA与RNA检测

        DNA测序适用于EGFR、KRAS、BRAF和PIK3CA等点突变、短片段插入缺失及部分拷贝数异常。RNA测序可直接检测异常融合转录本，更适合用于ALK、ROS1、RET和NTRK等基因融合分析。

（2）蛋白与染色体水平检测

        免疫组织化学可用于ALK、ROS1、PD-L1和MET等蛋白表达评价，荧光原位杂交可辅助确认基因重排和扩增。不同方法检测的是DNA、RNA、蛋白或染色体层面的不同事件，结果不一致时应结合样本质量和检测原理分析。

8.3 组织活检与液体活检

（1）组织活检

        组织活检可同时评价分子异常、蛋白表达和组织学转化，是确认小细胞肺癌转化、鳞状细胞癌转化及其他形态学改变的重要方法。但组织活检受到病灶位置、样本量和肿瘤空间异质性的影响。

（2）液体活检

        血浆循环肿瘤DNA检测适合动态监测突变谱、融合事件和耐药克隆。血浆检测阴性不能完全排除相应异常，低肿瘤负荷、胸腔局限病灶和中枢神经系统病灶均可能降低循环肿瘤DNA检出率。

8.4 实验评价指标

（1）体外评价

        体外研究可检测靶蛋白磷酸化、ERK和AKT活性、细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及克隆形成。耐药研究还应比较亲本细胞与耐药细胞的突变谱、蛋白表达和信号通路变化。

（2）体内评价

        体内研究除肿瘤体积和抑瘤率外，还应分析药物暴露、靶点抑制持续时间、中枢神经系统分布、脑转移控制和耐药亚克隆形成。仅依据短期肿瘤缩小不能完整评价耐药延缓和长期治疗效果。

9 NSCLC分子靶点、信号通路抑制剂与免疫检查点抗体产品

表3 EGFR、ALK与ROS1相关抑制剂产品

表4 KRAS–MAPK、RET、MET、HER2及PI3K–AKT–mTOR通路相关产品

参考文献

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