1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外成脂诱导及油红O染色鉴定流程，适用于骨髓、脂肪和脐带等来源MSCs的成脂分化研究。

1.2 方法原理

        地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、吲哚美辛和胰岛素可促进MSCs向脂肪细胞分化。诱导过程中，细胞内逐渐形成富含甘油三酯和中性脂质的脂滴。油红O可溶入细胞内中性脂质，使脂滴呈红色。

2 材料与试剂

2.1 细胞

（1）骨髓来源MSCs。

（2）脂肪来源MSCs。

（3）脐带来源MSCs。

建议使用生长状态良好、无支原体污染且分化潜能稳定的细胞。

2.2 主要试剂

（1）0.1%明胶包被液。

（2）MSC完全培养基。

（3）高糖DMEM培养基。

（4）胎牛血清（FBS）。

（5）青霉素-链霉素溶液（P/S）。

（6）地塞米松。

（7）3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）。

（8）吲哚美辛。

（9）胰岛素。

（10）胰蛋白酶细胞消化液。

（11）PBS。

（12）4%多聚甲醛固定液。

（13）油红O。

（14）异丙醇。

（15）蒸馏水或去离子水。

2.3 成脂诱导培养基A

以高糖DMEM为基础培养基，加入下列成分：

（1）10% FBS。

（2）1% P/S。

（3）地塞米松，终浓度1μM。

（4）IBMX，终浓度0.5mM。

（5）吲哚美辛，终浓度100μM。

（6）胰岛素，终浓度10μg/mL。

2.4 成脂诱导培养基B

以高糖DMEM为基础培养基，加入下列成分：

（1）10% FBS。

（2）1% P/S。

（3）胰岛素，终浓度10μg/mL。

培养基宜现用现配或分装保存，避免反复冻融。

2.5 主要器材

（1）6孔细胞培养板。

（2）CO₂培养箱。

（3）倒置显微镜。

（4）离心机。

（5）细胞计数仪或血球计数板。

3 实验分组

3.1 成脂诱导组

细胞使用成脂诱导培养基A和培养基B交替培养。

3.2 未诱导对照组

细胞使用不含地塞米松、IBMX、吲哚美辛和胰岛素的标准完全培养基培养。

3.3 重复设置

每组建议至少设置3个复孔，并保证细胞来源、代次、接种密度和培养时间一致。

4 实验流程

4.1 培养板包被

（1）向6孔板中加入适量0.1%明胶包被液，使液体完全覆盖孔底。

（2）室温孵育30min。

（3）吸弃包被液，避免孔底长时间干燥。

4.2 细胞消化与收集

（1）选择融合度约85%的MSCs。

（2）弃去原培养基，以PBS轻洗细胞。

（3）加入适量胰蛋白酶细胞消化液。

（4）待细胞逐渐脱离后，加入MSC完全培养基终止消化。

（5）收集细胞悬液，以300×g离心5min。

（6）弃上清，以MSC完全培养基重悬细胞。

4.3 细胞接种

（1）进行细胞计数并调整细胞浓度。

（2）按2×10⁴～3×10⁴ cells/cm²接种至明胶包被的6孔板。

（3）每孔加入2mL MSC完全培养基。

（4）置于37℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

4.4 成脂诱导

（1）待细胞融合度达到90%～100%时，吸弃MSC完全培养基。

（2）加入2mL预温的成脂诱导培养基A，培养2d。

（3）吸弃培养基A，加入2mL成脂诱导培养基B，培养1d。

（4）按照“培养基A培养2d、培养基B培养1d”的顺序交替诱导。

（5）未诱导对照组同步更换标准完全培养基。

（6）持续诱导约14d，显微镜下观察脂滴形成情况。

（7）当细胞内出现数量和大小适宜的脂滴后，进行油红O染色。

5 油红O工作液配制

5.1 油红O储备液

（1）称取0.5g油红O。

（2）加入100mL异丙醇。

（3）充分溶解后避光、密封保存。

5.2 油红O工作液

（1）按油红O储备液∶蒸馏水＝3∶2混合。

（2）充分混匀后静置。

（3）使用前以定性滤纸过滤，去除沉淀。

（4）工作液宜现配现用。

6 油红O染色

6.1 细胞固定

（1）吸弃培养基。

（2）以PBS轻洗细胞1～2次。

（3）加入4%多聚甲醛固定液，使其完全覆盖细胞层。

（4）室温固定30min。

（5）吸弃固定液，以PBS轻洗细胞1～2次。

6.2 染色

（1）加入适量油红O工作液，6孔板每孔加入约1mL。

（2）室温染色15～30min。

（3）吸弃染色液。

（4）以PBS或蒸馏水轻柔清洗3次。

（5）显微镜下观察并记录染色结果。

6.3 结果判读

细胞内中性脂质和脂滴经油红O染色后呈红色。成脂诱导组脂滴数量、面积和染色强度明显高于未诱导对照组，可支持成脂分化成功。

7 关键控制点

7.1 细胞状态

（1）细胞不宜过度传代。

（2）诱导前应保证细胞生长状态良好。

（3）不同来源MSCs不宜直接以同一阈值比较分化能力。

7.2 诱导起始融合度

细胞融合度达到90%～100%后再开始诱导。融合度不足可能降低成脂分化效率。

7.3 培养基交替

培养基A和培养基B的使用顺序及培养时间应保持一致。

7.4 油红O工作液

工作液使用前必须过滤，以减少染料结晶和非特异性沉淀。

8 常见问题与原因分析

8.1 脂滴形成较少

（1）细胞融合度不足。

（2）诱导时间过短。

（3）诱导成分浓度不准确或失效。

（4）细胞来源或代次导致成脂潜能较弱。

8.2 背景染色较深

（1）油红O工作液未充分过滤。

（2）染色时间过长。

（3）染色后清洗不充分。

8.3 细胞层脱落

（1）固定、换液或清洗操作过于剧烈。

（2）细胞贴壁状态不佳。

（3）消化时间过长或接种密度不适宜。

9 安全与废弃物处理

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）异丙醇易燃，应远离火源并在通风条件下操作。

（3）多聚甲醛固定操作应在通风良好的条件下进行。

（4）含异丙醇、油红O和多聚甲醛的废液应分类收集并按实验室规范处理。

10 间充质干细胞成脂分化及油红O染色鉴定相关产品

更多相关文章，详见下方：

[1] 用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化实验

[2] 间充质干细胞（MSCs）鉴定