1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立Thomas磷钼酸苏木素法的常规染色流程，适用于石蜡组织切片中胶原纤维、粗网状纤维及嗜银细胞颗粒的显示，可用于结缔组织成分观察、粗网状结构识别以及部分含嗜银颗粒细胞的形态学研究。

1.2 原理简介

（1）Thomas磷钼酸苏木素法属于磷钼酸媒染型苏木素染色方法，主要通过磷钼酸与苏木素体系对不同组织成分的亲和差异实现选择性着色。

（2）该方法对胶原纤维、粗网状纤维及嗜银细胞颗粒具有较好的显示效果，其中胶原纤维和粗网状纤维多呈紫色至黑色，嗜银细胞颗粒呈黑色。

（3）细胞核在该体系中通常呈淡蓝色，有助于与深染纤维及颗粒结构形成层次对比。

1.3 染色质量要求

（1）胶原纤维与粗网状纤维着色清晰，呈紫色至黑色。

（2）嗜银细胞颗粒着色明确，呈黑色。

（3）细胞核淡蓝，背景较干净，组织轮廓完整。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）常规石蜡组织切片。

（2）需要显示胶原纤维或粗网状纤维的组织切片。

（3）含嗜银细胞颗粒成分的相关组织切片。

2.2 主要试剂

（1）Thomas磷钼酸苏木素染色液。

（2）Thomas分化液。

（3）系列乙醇。

（4）蒸馏水。

（5）二甲苯或脱蜡透明液。

（6）中性树胶。

2.3 自备固定体系

（1）常规组织学固定液。

（2）避免采用重铬酸类固定液。

2.4 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）染色缸。

（3）镊子、吸水纸。

（4）石蜡切片机。

（5）显微镜。

3 染液与样本准备

3.1 固定要求

（1）组织样本按常规方法固定、脱水和包埋。

（2）不宜采用重铬酸类固定液，以免影响染色效果。

（3）同批样本应尽量采用一致的固定和包埋条件，以减少批间差异。

3.2 切片要求

（1）石蜡切片厚度应保持一致。

（2）切片附着应牢固，避免脱蜡和分化过程中脱片。

（3）进入染色前，切片应充分脱蜡并水化至水。

3.3 脱蜡与水化要求

（1）石蜡切片经二甲苯或脱蜡透明液脱蜡。

（2）经系列乙醇逐级水化至水。

（3）脱蜡不彻底或水化不足均可能导致染色不均。

4 实验流程

4.1 脱蜡与水化

（1）常规组织固定、脱水、包埋后制成石蜡切片。

（2）切片经二甲苯或脱蜡透明液脱蜡。

（3）经系列乙醇水化至水。

4.2 Thomas磷钼酸苏木素染色

（1）将切片置于Thomas磷钼酸苏木素染色液中染色2 min。

（2）取出后用蒸馏水冲洗。

（3）染色时间不宜过长，以免背景加深。

4.3 Thomas分化液分化

（1）向切片滴加Thomas分化液进行分化。

（2）分化后立即以蒸馏水快速冲洗。

（3）再以自来水冲洗2 min。

（4）该步骤应控制至背景减浅、目标结构保留清晰深染为宜。

4.4 脱水、透明与封片

（1）切片经95%乙醇和无水乙醇迅速脱水。

（2）再按常规流程完成脱水。

（3）转入二甲苯或脱蜡透明液中透明。

（4）滴加中性树胶，覆盖盖玻片，完成封片。

（5）封片后应避免产生气泡，并保持胶液分布均匀。

5 染色结果

5.1 胶原纤维与粗网状纤维

（1）胶原纤维呈紫色至黑色。

（2）粗网状纤维呈紫色至黑色。

5.2 嗜银细胞颗粒

（1）嗜银细胞颗粒呈黑色。

5.3 细胞核

（1）细胞核呈淡蓝色。

6 结果判读要点

6.1 纤维成分判读

（1）胶原纤维和粗网状纤维深染清晰时，有利于观察间质结构和纤维分布。

（2）若目标纤维着色偏浅，应优先检查染色时间、分化程度及固定条件。

6.2 嗜银细胞颗粒判读

（1）嗜银细胞颗粒呈黑色时，通常较易与周围组织区分。

（2）判读时应结合颗粒分布位置及组织背景综合分析。

6.3 细胞核判读

（1）细胞核呈淡蓝色时，可作为组织定位和结构参照。

（2）若核染过深，可能影响对深染纤维与颗粒的观察。

7 常见问题与原因分析

7.1 目标结构着色偏淡

（1）染色时间不足。

（2）分化过度。

（3）固定体系不合适，尤其使用重铬酸类固定液时更易影响染色。

7.2 背景偏深

（1）Thomas磷钼酸苏木素染色时间过长。

（2）分化不足。

（3）切片脱蜡不充分或组织残留杂质较多。

7.3 目标结构与背景分界不清

（1）分化液处理不稳定。

（2）冲洗不及时，导致分化终点不一致。

（3）同批切片厚度或固定条件不一致，导致染色差异。

7.4 切片发灰或透明度差

（1）脱水不充分。

（2）透明不足。

（3）封片前残留水分，影响镜下观察。

8 应用范围

8.1 结缔组织观察

（1）用于显示胶原纤维分布。

（2）用于显示粗网状纤维分布。

8.2 嗜银细胞相关结构观察

（1）用于观察嗜银细胞颗粒。

（2）适合相关细胞成分的辅助识别。

8.3 组织学形态研究

（1）适用于常规组织切片中特定纤维成分的对比显示。

（2）可作为其他纤维染色方法的补充观察手段。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理二甲苯、脱蜡液及染色液时应在通风条件良好的环境下操作。

9.2 废液处理

（1）含乙醇、二甲苯及染色残液的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品处理规范处置。

10 Thomas磷钼酸苏木素法相关试剂选型