引言

         半胱氨酸是靶向共价药物发现中最常利用的氨基酸残基之一。其侧链硫醇具有较强的亲核反应潜力，可以与丙烯酰胺等亲电基团形成稳定共价键。靶向共价抑制剂通常先依靠配体骨架与蛋白形成特异性非共价复合物，再利用适当布置的共价反应基团（covalent reactive group，CRG），即常说的共价弹头（warhead），捕获结合位点附近的半胱氨酸。[1]

         晶体结构中观察到弹头靠近半胱氨酸，并不能直接推出二者一定能够形成共价键。共价成键受到三个关键因素共同控制：共价弹头的本征反应性、配体结合后形成的反应几何，以及目标半胱氨酸在局部蛋白微环境中的反应性。

         McAulay 等对 c-KIT 共价抑制剂的研究提供了实验例证。面向 Cys788 设计的丙烯酰胺化合物 25 与 c-KIT 保持非共价结合；将弹头更换为炔基苯并噁嗪后，化合物 26 在晶体结构中与同一 Cys788 形成共价键。同一化合物 26 与结构相关的 KDR 激酶结合时，弹头发生明显构象翻转，并保持非共价结合。[4] 这一组结构对照将弹头反应性、空间取向和蛋白微环境三个因素联系在同一体系中。

本文核心缩写与结构编号说明

1. 共价抑制包含分子识别和化学反应两个阶段

典型两步不可逆共价抑制过程可以简化表示为：

         P + L ⇌ P·L → P–L

         其中，P 为蛋白，L 为配体，P·L 为反应前的非共价蛋白—配体复合物，P–L 为形成共价键后的加合物。

         第一阶段由常规分子识别控制。配体进入结合口袋后，通过形状互补、氢键、静电作用和疏水作用等形成非共价复合物。

         第二阶段发生化学反应。已经定位于结合位点中的共价弹头与目标残基反应，将非共价复合物转化为共价加合物。

         对于符合这一两步模型的不可逆抑制剂，K_I 用于描述反应前复合物形成所涉及的表观结合参数，k_inact 表示该复合物转化为共价失活状态的最大一级速率常数，k_inact/K_I 常用于评价不可逆抑制效率。[5]

         这两个阶段可以彼此分离。两个化合物即使具有相近的非共价结合能力，只要共价成键速率不同，其时间依赖性抑制和靶点占有也可能明显不同。普通终点 IC₅₀ 又会受到孵育时间、底物浓度和实验条件影响，因此对于不可逆共价抑制剂，单一 IC₅₀ 通常不能完整描述非共价结合与后续共价反应。[5]

2. 蛋白中的半胱氨酸具有不同的反应性

         半胱氨酸本身具有较强的亲核反应潜力，但不同蛋白、不同位置上的半胱氨酸并不是性质相同的一组反应位点。

         Weerapana 等利用定量反应性蛋白质组学研究发现，蛋白质中不同半胱氨酸对亲电探针的反应性差异很大，高反应性半胱氨酸只占检测位点的一部分，并且常出现在催化、氧化还原调节及其他功能位点。[2]

         对于典型的半胱氨酸亲核反应，去质子化形成的硫负离子通常比中性硫醇具有更强的亲核性。半胱氨酸侧链的酸碱性质因此会影响反应速率，但 pKₐ 并不是唯一决定因素。局部静电环境、氢键网络、溶剂暴露程度、侧链构象以及亲核体相对于弹头的取向都可能改变最终的反应效率。[3]

         Awoonor-Williams 和 Rowley 对蛋白激酶中潜在可共价靶向半胱氨酸进行计算分析，也显示不同位点的预测酸碱性质和反应环境存在明显差异。[3]

         因此，结合口袋中存在一个空间位置合适的 Cys，只能确定一个潜在共价靶点。进一步的设计还需要考虑该半胱氨酸在具体蛋白构象中的化学状态以及它能否形成适合亲核进攻的空间构型。

3. 共价弹头需要合适的反应性窗口

         提高弹头的亲电性通常能够增强其与硫亲核体发生反应的倾向，但靶向共价药物需要控制这种反应性。

         反应性过低时，即使配体已经将弹头定位于目标半胱氨酸附近，在有限的结合时间内也可能无法有效完成共价捕获。反应性过高时，化合物则可能与谷胱甘肽（glutathione，GSH）、其他蛋白中的半胱氨酸以及其他生物亲核体发生过快反应，从而增加非特异性加合和脱靶风险。

         McAulay 等在开发新型半胱氨酸弹头时，系统比较了不同结构与 GSH 的反应以及在 pH 7.4 缓冲液中的稳定性。部分早期亲电杂环与 GSH 反应很快，同时表现出较差的稳定性；随后得到的炔基苯并噁嗪 5e 在相同研究体系中表现出较平衡的性质，其 GSH 反应半衰期为 82 min，而缓冲液中的半衰期超过 10,000 min。[4]

         这一结果体现的是反应性窗口：共价弹头需要保留足够的化学反应能力，使靶蛋白提供的有利环境能够促进成键，同时维持足够的化学稳定性，降低在复杂生物体系中的非选择性反应。

         GSH 半衰期适合在统一实验条件下比较一系列弹头的相对反应性，但不能作为跨实验体系通用的“最佳数值”。其结果会受到化合物浓度、GSH 浓度、pH、温度和分析方法等因素影响。[4]

4. c-KIT Cys788：丙烯酰胺为什么没有形成预期共价键

         McAulay 等以能够结合 c-KIT 的激酶抑制剂骨架为起点。已有结构显示，该骨架的一条侧链朝向 Cys788，因此研究者利用这一位置引入半胱氨酸反应基团。[4]

         由此得到的化合物 25 含有经典的丙烯酰胺 Michael 受体。其设计目标是使丙烯酰胺进入 Cys788 附近，从而发生硫醇对 α,β-不饱和酰胺的亲核加成。

         X 射线晶体结构显示，化合物 25 与 c-KIT 的结合仍然是非共价的。对应结构为 PDB 6XVA。丙烯酰胺侧链具有较大的构象自由度，在真实结合位点中向后弯折，远离 Cys788，并与局部水网络形成相互作用。[4]

这一结果说明需要区分空间邻近与反应几何两个结构因素：

         空间邻近描述弹头能否到达目标残基附近；

         反应几何描述亲核原子与亲电中心能否以适合成键的方向和距离排列。

         对于 Michael 加成等具有明确轨道和几何要求的反应，弹头仅仅位于半胱氨酸附近并不足够。连接链的柔性、水网络和局部非共价相互作用都可能稳定一个不利于化学反应的结合构象。

         化合物 25 的结构因此直接说明，共价弹头需要在结合状态下保持有效反应取向，而不能只依据设计模型中的静态距离判断成键能力。

5. 炔基苯并噁嗪同时改变反应性和反应构象

         研究人员进一步将丙烯酰胺替换为构象受限的炔基苯并噁嗪弹头，得到化合物 26。

         该设计最初建立在两个考虑之上。第一，新的弹头具有不同于普通丙烯酰胺的硫醇反应性；第二，环状结构提高了局部刚性，有利于维持指向目标残基的反应矢量。作者明确将这种“通过刚性结构固定 Michael 受体反应方向”作为设计假设之一。[4]

         X 射线晶体结构最终观察到化合物 26 与 c-KIT Cys788 形成共价键，对应 PDB 6XVB。[4] RCSB PDB 对该结构的描述同样明确标注为与 Cys788 共价结合。

         在相同研究体系中，化合物 26 的 GSH 反应半衰期约为 65 min，其 GSH 反应性约为对应丙烯酰胺 25 的两倍。[4] 作者还引用了 Awoonor-Williams 和 Rowley 对 c-KIT Cys788 的计算结果：在所研究的 DFG-in 和 DFG-out 构象中，该位点的硫醇 pKₐ 均被预测为高于 21，提示形成具有较强亲核性的硫负离子可能存在较高去质子化障碍。[3,4]

         这里的 pKₐ > 21 是特定计算模型得到的预测值，并不是 Cys788 的实验测定值。该结果用于说明作者为什么考虑提高弹头反应性，不能作为蛋白环境中 Cys788 实际 pKₐ 的直接实验结论。

从化合物 25 到 26，至少两个因素同时发生变化：

         ① 弹头对硫亲核体的本征反应性提高；

         ② 弹头在蛋白结合状态下的构象约束和反应取向发生改变。

         因此，化合物 26 的成功共价捕获不能单独归因于“亲电性增强”。原研究提出的解释正是低亲核性目标半胱氨酸、弹头反应性和刚性反应矢量共同作用。[4]

         研究中的酶活数据也提供了重要的证据边界。在 300 μM ATP 条件下，化合物25对 c-KIT 的 IC₅₀ 为 0.240 μM，化合物26为2.08 μM；26 虽然在共晶结构中形成共价键，但该条件下的酶活 IC₅₀ 并没有降低。[4]

         作者同时指出，共结晶实验中蛋白和化合物浓度较高，可能促进晶体条件下的共价键形成，而这种成键程度未必与体外活性测定中的状态完全相同。[4] 因此，6XVB 提供的是明确的结构成键证据，但不能仅凭这一结构推断化合物 26 在所有生化或细胞条件下都具有同样程度的不可逆靶点占有。

6. 相同化合物在 c-KIT 和 KDR 中形成不同的反应构象

         化合物 26 与 c-KIT 和 KDR 的结构比较进一步显示，局部蛋白环境可以直接改变弹头的空间取向。

         原研究首先比较了两个激酶中对应半胱氨酸的构象，即 c-KIT Cys788 与 KDR Cys1024。作者对已有 PDB 结构进行分析后发现，在大多数所分析的 c-KIT 结构中，Cys788 朝向活性位点；在约 80% 的所分析 KDR 结构中，Cys1024 则朝向口袋外侧。两个结合位点的邻近残基和口袋形状也存在差异。[4]

         化合物 26 与 c-KIT 的结构中，弹头与 Cys788 共价结合；与 KDR 的结构 PDB 6XVK 中，化合物 26 保持非共价结合。[4]

         两个复合物中的喹啉和吡啶核心保持相似的结合相互作用，但苯并噁嗪弹头在 KDR 中相对于 c-KIT 结构发生约 180° 翻转。这一翻转使末端甲基炔基进入 KDR 的一个疏水口袋，从而离开 c-KIT 中能够完成共价捕获的反应取向。[4]

因此，共价选择性还可来源于蛋白结合口袋对弹头构象的选择：

         蛋白结合口袋不仅决定配体是否能够结合，也能够通过稳定不同的弹头构象，控制后续化学反应是否具有合适的几何条件。

         两个相关蛋白即使在相应位置都具有潜在可靶向的半胱氨酸，同一个共价弹头也可能产生不同的成键结果。局部空间形状、邻近残基、水网络以及配体构象共同决定实际的反应构象和成键结果。

7. 共价作用需要从化学反应性建立到细胞选择性的证据链

         靶向共价化合物的评价需要区分弹头本征反应性、蛋白共价修饰和生物体系选择性三个层次。

7.1 弹头反应性与稳定性

         GSH 等模型硫醇反应可以比较弹头与生物相关亲核体发生反应的倾向；缓冲液稳定性用于判断化合物在没有目标亲核体时是否容易发生水解或其他降解。

         这类实验回答的是弹头本身有多容易发生化学反应，不能单独证明靶点选择性。

7.2 完整蛋白共价加合

         完整蛋白质谱可以检测化合物处理后蛋白是否产生与配体质量相符的质量增加，是不可逆共价命中确认的重要手段。[1]

         该实验能够证明稳定蛋白—配体加合物的形成，但质量增加本身通常不能确定具体修饰残基。

7.3 共价修饰位点

         蛋白酶解结合肽段质谱和 MS/MS 可以进一步定位发生修饰的氨基酸残基，从而判断共价反应是否发生在预期 Cys 位点。[1]

7.4 结构验证

         X 射线晶体结构可以同时提供配体结合模式、弹头取向和目标残基周围的空间环境。c-KIT 中化合物 25、26 以及 KDR 中化合物 26 的结构对照表明，结构生物学对于区分“接近目标残基”和“形成有效反应构象”具有直接价值。[4]

7.5 细胞和蛋白质组选择性

         进入细胞后，共价弹头面对大量潜在亲核位点。Lanning 等利用活性蛋白质组分析结合定量质谱，对共价激酶抑制剂的蛋白质组范围选择性进行了系统研究，并提出不同化合物存在相应的选择性窗口；超过这一窗口后，可以出现广泛的蛋白质组反应以及与主要激酶靶点无关的细胞死亡。[6]

         靶向共价设计追求的结果是：目标位点的有效共价反应在相关暴露条件下明显优于无关蛋白中的竞争反应。

8. 从反应位点到共价化合物的设计顺序

8.1 先评价目标半胱氨酸

         半胱氨酸的位置、溶剂暴露程度、局部构象和微环境决定其是否具有可利用的反应条件。单独依据蛋白序列中存在 Cys，或晶体结构中 Cys 与配体距离较近，都不足以判断其可共价靶向性。[2–4]

8.2 再选择弹头反应性

         目标残基反应性较低时，过于温和的弹头可能无法获得足够成键速率；弹头反应性过高又会增加非选择性反应。GSH 反应和化学稳定性可用于建立同一系列化合物的相对反应性范围。[4]

8.3 同时优化反应矢量

         连接位置、连接链长度、构象柔性以及环系刚性决定弹头在结合状态下的位置和方向。c-KIT 化合物 25 和 26 的结构差异说明，反应矢量可以直接决定一个已经进入正确口袋的亲电基团能否完成共价成键。[4]

8.4 最终验证真实的共价选择性

         完整蛋白质谱、肽段质谱、结构生物学以及细胞和蛋白质组层面的评价共同组成共价选择性的验证证据链，具体验证层次见第7节。[1,6]

         对于符合两步不可逆抑制模型的化合物，K_I、k_inact 和 k_inact/K_I 进一步区分反应前结合与后续共价失活过程。[5]

9. 半胱氨酸靶向共价成键机制、弹头反应性与验证研究相关代表化学品

表1. 半胱氨酸反应性、巯基状态与反应性评价试剂

表2. 半胱氨酸靶向共价弹头与亲电反应研究试剂

表3. 半胱氨酸靶向共价抑制剂及靶点选择性研究化合物

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参考文献

[1] Lucas, S. C. C.; Blackwell, J. H.; Hewitt, S. H.; Semple, H.; Whitehurst, B. C.; Xu, H. Covalent hits and where to find them. SLAS Discovery 2024, 29(3), 100142. DOI: 10.1016/j.slasd.2024.01.003.

[2] Weerapana, E.; Wang, C.; Simon, G. M.; Richter, F.; Khare, S.; Dillon, M. B. D.; Bachovchin, D. A.; Mowen, K.; Baker, D.; Cravatt, B. F. Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes. Nature 2010, 468, 790–795. DOI: 10.1038/nature09472.

[3] Awoonor-Williams, E.; Rowley, C. N. How Reactive are Druggable Cysteines in Protein Kinases? Journal of Chemical Information and Modeling 2018, 58(9), 1935–1946. DOI: 10.1021/acs.jcim.8b00454.

[4] McAulay, K.; Hoyt, E. A.; Thomas, M.; Schimpl, M.; Bodnarchuk, M. S.; Lewis, H. J.; Barratt, D.; Bhavsar, D.; Robinson, D. M.; Deery, M. J.; Ogg, D. J.; Bernardes, G. J. L.; Ward, R. A.; Waring, M. J.; Kettle, J. G. Alkynyl Benzoxazines and Dihydroquinazolines as Cysteine Targeting Covalent Warheads and Their Application in Identification of Selective Irreversible Kinase Inhibitors. Journal of the American Chemical Society 2020, 142(23), 10358–10372. DOI: 10.1021/jacs.9b13391.

[5] Miyahisa, I.; Sameshima, T.; Hixon, M. S. Rapid Determination of the Specificity Constant of Irreversible Inhibitors (k_inact/K_I) by Means of an Endpoint Competition Assay. Angewandte Chemie International Edition 2015, 54(47), 14099–14102. DOI: 10.1002/anie.201505800.

[6] Lanning, B. R.; Whitby, L. R.; Dix, M. M.; Douhan, J.; Gilbert, A. M.; Hett, E. C.; Johnson, T. O.; Joslyn, C.; Kath, J. C.; Niessen, S.; Roberts, L. R.; Schnute, M. E.; Wang, C.; Hulce, J. J.; Wei, B.; Whiteley, L. O.; Hayward, M. M.; Cravatt, B. F. A road map to evaluate the proteome-wide selectivity of covalent kinase inhibitors. Nature Chemical Biology 2014, 10, 760–767. DOI: 10.1038/nchembio.1582.

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