1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立Bennhold刚果红法的常规染色流程，适用于石蜡组织切片中淀粉样物质的显示与形态学观察，可用于病理组织学研究、淀粉样沉积评估及相关实验室常规染色操作。

1.2 方法原理

（1）刚果红可与淀粉样物质中排列有序的纤维结构结合，在普通光镜下使其呈橙红色至砖红色。

（2）经适当分化后，背景组织着色减弱，而淀粉样沉积仍保留较强染色，从而提高组织对比度。

（3）在偏振光条件下，淀粉样物质可表现为苹果绿或黄绿色双折射，是刚果红法判读的重要辅助依据。

1.3 染色质量要求

（1）淀粉样物质着色清晰，与背景组织对比明确。

（2）细胞核染色适中，组织结构完整。

（3）背景不过深，无明显非特异性沉积和过度分化。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）石蜡包埋组织切片。

（2）适用于怀疑存在淀粉样沉积的各类组织样本。

2.2 主要试剂

（1）固定液。

（2）二甲苯。

（3）梯度乙醇。

（4）Bennhold苏木素。

（5）酸性乙醇分化液。

（6）Scott蓝化液。

（7）刚果红染色液。

（8）Bennhold分化液。

（9）中性树胶。

2.3 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）染色缸。

（3）镊子、吸水纸。

（4）光学显微镜。

（5）偏振光显微镜或带偏振附件的显微镜。

3 样本与染液准备

3.1 固定与包埋

（1）组织按常规方法固定、脱水和石蜡包埋。

（2）固定条件应尽量一致，以减少染色差异。

3.2 切片要求

（1）石蜡切片厚度为 4 μm。

（2）切片应完整、平整，避免皱褶和脱片。

3.3 染液要求

（1）各染液使用前应确认无明显沉淀或污染。

（2）刚果红染色液和分化液应按实验室常规要求保存和更换。

（3）分化步骤宜先小范围预试，便于控制终点。

4 实验流程

4.1 脱蜡与复水

（1）石蜡切片常规脱蜡至水。

（2）经梯度乙醇复水后进入水相染色步骤。

4.2 核染色

（1）将切片置于Bennhold苏木素中浸染。

（2）染色时间应根据染液状态和组织类型适当调整，以获得清晰核染为宜。

4.3 分化

（1）将切片置于酸性乙醇分化液中分化。

（2）分化后立即入水终止分化。

（3）水洗 2 次后于镜下控制至恰当程度，避免核染过浅或背景过深。

4.4 蓝化

（1）自来水冲洗。

（2）将切片置于Scott蓝化液中返蓝。

（3）返蓝后再以自来水冲洗。

4.5 刚果红染色

（1）将切片置于刚果红染色液中浸染。

（2）染色时间应根据切片厚度、组织成分和染液状态进行适当控制。

4.6 分化与终止

（1）将切片置于Bennhold分化液中迅速分化。

（2）分化后立即以自来水冲洗 1～2 min。

（3）该步骤应控制迅速，避免淀粉样物质颜色减弱。

4.7 脱水、透明与封片

（1）切片经逐级乙醇常规脱水。

（2）转入二甲苯透明。

（3）滴加中性树胶并覆盖盖玻片，完成封固。

5 染色结果

5.1 普通光镜下

（1）淀粉样物质呈橙红色、红色或砖红色。

（2）细胞核呈蓝色。

（3）其他背景组织着色相对较淡。

5.2 偏振光下

（1）淀粉样物质可见苹果绿或黄绿色双折射。

（2）偏振光结果宜结合普通光镜形态综合判断。

6 结果判读要点

6.1 阳性判读

（1）组织内出现均质、团块状或血管壁、间质沉积样红染物质时，应考虑淀粉样沉积。

（2）若在偏振光下进一步出现苹果绿双折射，可增强对淀粉样物质的支持判断。

6.2 背景判读

（1）背景过深时，易影响弱阳性沉积识别。

（2）背景过浅或分化过强时，可能导致淀粉样物质信号减弱。

6.3 判读注意点

（1）应结合沉积部位、形态分布及偏振光表现综合判断。

（2）仅凭单一红染物质不能机械等同于淀粉样沉积，应注意与胶原、纤维素样物质及染色沉淀区分。

7 常见问题与原因分析

7.1 淀粉样物质着色偏弱

（1）刚果红染色时间不足。

（2）Bennhold分化液分化过度。

（3）切片过薄或组织中淀粉样沉积本身较少。

7.2 背景过深

（1）刚果红染色过久。

（2）分化不足。

（3）切片脱蜡或复水不充分，影响染液进入和分化效果。

7.3 细胞核不清

（1）苏木素染色不足。

（2）酸性乙醇分化过度。

（3）返蓝不足。

7.4 偏振光下双折射不明显

（1）淀粉样物质含量较少。

（2）分化过强导致结合染料减少。

（3）偏振光观察条件或切片质量不佳。

8 质量控制

8.1 切片质量控制

（1）切片厚度应保持一致。

（2）切片应完整、平展，避免皱褶和脱片。

8.2 染液质量控制

（1）刚果红染色液、苏木素和分化液应按规定更换。

（2）发现染液污染、沉淀或着色异常时应及时处理。

8.3 操作一致性控制

（1）同批样本应尽量采用一致的染色和分化时间。

（2）镜下控制分化终点时，应由熟练人员操作，以减少批间差异。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理二甲苯、乙醇及染色液时应在通风良好的环境中操作。

（1）含二甲苯、乙醇及染色残液的废液应分类收集。

（2）所有污染耗材和废液应按实验室化学品处理规范处置。

10 Bennhold刚果红法相关试剂与材料选型

表 1 Bennhold刚果红法淀粉样物质染色相关试剂与材料选型

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[1] 淀粉样物质刚果红染色中Highman、Bennhold、Puchtler及改良法的应用区别