CAR-T细胞疗法已在多种血液系统恶性肿瘤中取得显著疗效，但体外细胞制造周期长、流程复杂。体内靶向递送技术的发展，为直接在患者体内生成CAR-T细胞提供了新的工程化路径。

        关键词：CAR-T细胞；ex vivo CAR-T；in vivo CAR-T；嵌合抗原受体；T细胞工程化；慢病毒载体；脂质纳米颗粒；靶向递送；细胞治疗；临床转化

1 CAR-T细胞疗法的作用原理与技术演进

1.1 嵌合抗原受体的结构组成

        嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）通常由抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区组成。抗原结合区负责识别肿瘤细胞表面抗原，铰链区调节受体与靶抗原之间的空间距离，跨膜区影响受体稳定性和膜定位，胞内CD3ζ结构域触发T细胞活化，CD28或4-1BB等共刺激结构域则调节细胞增殖、代谢状态和功能持续性。

1.2 CAR-T细胞的靶向杀伤机制

        CAR与靶抗原结合后可促进免疫突触形成，使T细胞释放穿孔素和颗粒酶，并产生IFN-γ、TNF和IL-2等细胞因子。CAR介导的识别不依赖主要组织相容性复合体呈递，因此能够直接识别肿瘤细胞表面抗原，但无法识别仅存在于细胞内且未呈现在细胞表面的靶分子。

1.3 CAR结构的功能演进

        第一代CAR主要含CD3ζ信号结构域，细胞扩增和持续性有限；第二代CAR加入一种共刺激结构域，是当前较常用的设计；第三代CAR组合两种共刺激信号，后续设计则进一步引入细胞因子表达模块、安全开关和多抗原逻辑门。CAR结构复杂度增加并不必然提高疗效，信号强度仍需与T细胞持续性、功能衰竭和治疗毒性相匹配。

1.4 从ex vivo到in vivo的技术路径变化

        Ex vivo CAR-T在体外完成T细胞分离、激活、基因导入和扩增，再将工程化细胞回输患者体内；in vivo CAR-T则通过病毒或非病毒载体，将CAR编码序列直接递送至患者体内的T细胞。两条路径可以采用相似的CAR结构，核心差异在于细胞工程化发生的位置、治疗制剂形态以及给药前能够实施的质量控制程度。

2 Ex vivo CAR-T的细胞工程化流程与质量控制

图1 Ex vivo CAR-T的细胞采集、体外工程化与回输流程

2.1 起始细胞采集与富集

        Ex vivo CAR-T通常从患者外周血单个核细胞中分离T细胞，也可进一步富集CD4⁺、CD8⁺、初始或记忆T细胞亚群。患者既往治疗、外周血淋巴细胞数量和T细胞功能状态会影响起始材料质量，并进一步影响基因转导效率、细胞扩增能力和最终细胞组成。

2.2 T细胞激活

        抗CD3与抗CD28抗体或包被磁珠可同时提供TCR信号和共刺激信号，使静息T细胞进入增殖状态并提高基因导入效率。激活不足会限制转导和扩增，持续或过强刺激则可能促进终末分化、活化诱导性细胞死亡和功能衰竭，因此需要控制刺激强度与持续时间。

2.3 CAR基因导入

        慢病毒和逆转录病毒载体可将CAR序列稳定导入T细胞基因组，适合获得持续表达；转座子系统可在非病毒条件下实现稳定整合；mRNA电转则形成短暂CAR表达，适合高风险靶点或可逆性功能验证。不同方式在表达持续时间、载荷容量、操作复杂度和遗传安全性方面存在差异。

2.4 体外扩增与细胞表型调控

        基因改造后的T细胞需在细胞因子支持下扩增至治疗所需数量。IL-2可促进快速增殖，但持续高强度IL-2信号可能推动效应化；IL-7和IL-15有助于维持部分初始样或记忆样表型，IL-21可调节T细胞分化和效应功能。培养时间、细胞密度、营养环境、刺激持续时间以及CD4⁺/CD8⁺比例均会影响CAR-T细胞的体内扩增和持续性。

2.5 收获、制剂化与保存

        扩增结束后需对CAR-T细胞进行洗涤、浓缩、配制和必要的冻存。冻存与复苏可能降低细胞活率，并暂时影响细胞代谢和杀伤功能，因此需要比较冻存前后的活率、CAR表达、细胞组成和效力，确认保存过程不会造成不可接受的功能损失。

2.6 放行检测与质量评价

        回输前通常需要检测细胞身份、纯度、活率、CAR阳性率、细胞剂量、体外效力、无菌、支原体和内毒素等指标。使用整合型载体时还需关注载体拷贝数、复制型病毒及长期遗传安全性。CAR阳性率只能反映受体表达，不能替代细胞杀伤、增殖和细胞因子释放等功能评价。

2.7 预处理、回输与体内监测

        患者通常在CAR-T回输前接受淋巴清除预处理，以减少内源性淋巴细胞竞争并提高支持性细胞因子水平。回输后需动态监测CAR-T细胞扩增、持续时间、肿瘤负荷、血细胞变化和炎症因子，并及时识别细胞因子释放综合征和神经毒性。

3 Ex vivo CAR-T的治疗优势与应用局限

3.1 回输细胞可检测和筛选

        Ex vivo路径允许在回输前直接检测细胞数量、CAR表达、细胞亚群组成和体外效力，并排除不符合质量要求的批次。研究人员还可调整CD4⁺与CD8⁺细胞比例、培养条件和输入剂量，对回输细胞实施较完整的过程控制。

3.2 复杂细胞工程的实施能力

        体外培养为多位点基因编辑、受体改造和功能筛选提供了操作空间。除导入CAR外，还可敲除内源性TCR或免疫检查点，导入趋化因子受体、细胞因子模块或安全开关，并在回输前评价各项改造是否达到预期。

3.3 制造周期与物流复杂度

        Ex vivo CAR-T涉及细胞采集、运输、激活、转导、扩增、检测、冻存和回输等多个步骤，对GMP设施、人员操作、质量体系和冷链物流要求较高。疾病快速进展、起始细胞不足或制造失败可能延长治疗等待时间，甚至使患者错过适宜治疗窗口。

3.4 起始细胞和批次差异

        患者年龄、既往治疗、疾病负荷和免疫状态会造成T细胞数量与功能差异。相同制造流程在不同患者中可能产生不同的扩增效率、CAR阳性率、分化表型和杀伤活性，使自体CAR-T难以完全消除批次间波动。

3.5 治疗相关毒性

        CAR-T细胞快速扩增和免疫细胞大量活化可引起细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）。当靶抗原同时存在于正常组织时，还可能产生on-target/off-tumor损伤。

3.6 抗原逃逸与功能衰竭

        肿瘤可通过降低靶抗原表达、选择抗原阴性细胞或发生谱系改变逃避CAR-T识别。持续抗原刺激还会诱导抑制性受体升高、代谢障碍和表观遗传状态固定，使CAR-T细胞逐渐失去增殖和杀伤能力。

3.7 实体瘤治疗障碍

        实体瘤中的异常血管、致密细胞外基质和趋化信号不匹配会限制CAR-T细胞浸润。低氧、营养竞争、TGF-β、免疫抑制细胞和抗原异质性还会削弱其功能，因此实体瘤CAR-T需要同时解决靶点选择、组织迁移、局部免疫抑制和正常组织毒性问题。

4 In vivo CAR-T的原位工程化机制

4.1 体内直接生成CAR-T细胞

        In vivo CAR-T通过静脉或局部给药，将携带CAR编码序列的递送系统送入患者体内。载体依次完成循环稳定、组织分布、T细胞识别、细胞摄取和胞内释放，使内源性T细胞表达CAR并获得靶细胞识别与杀伤能力。

图2 In vivo CAR-T的靶向递送、原位工程化与肿瘤杀伤过程

4.2 CAR编码载荷的形式

        体内递送可使用整合型DNA、非整合型DNA或mRNA。整合型序列能够形成较持久的CAR表达，但需要控制非目标细胞转导和插入相关风险；mRNA可在胞质中直接翻译，不进入基因组，表达时间相对有限，更便于通过给药剂量和频率调节作用强度。

4.3 T细胞靶向识别

        递送载体可通过抗体、抗体片段、配体或工程化病毒包膜识别CD3、CD4、CD8等T细胞表面分子。靶向分子决定载体进入的细胞亚群，同时可能改变T细胞活化、组织分布和载体内吞。载体能够与T细胞结合并不等同于完成有效CAR表达。

4.4 细胞摄取与胞内释放

        载体与T细胞结合后通常经内吞进入细胞，核酸载荷必须从内体中释放，并根据核酸类型到达胞质或细胞核。mRNA主要需要完成内体逃逸和胞质释放，DNA还需进一步进入细胞核，其中任一环节效率不足都会限制CAR阳性细胞比例。

4.5 体内扩增和药效建立

        In vivo CAR-T的有效剂量不能仅由递送制剂的给药量表示，还取决于T细胞转导率、单细胞CAR表达量、转导细胞的分化状态及其体内扩增。患者免疫状态、载体清除速度和肿瘤抗原负荷均会影响CAR-T细胞生成和药效动力学。

5 In vivo CAR-T的病毒与非病毒递送系统

5.1 工程化慢病毒和逆转录病毒载体

        慢病毒和逆转录病毒具有较高的基因转导能力。通过更换病毒包膜或连接T细胞靶向配体，可降低天然细胞嗜性并增强对特定T细胞亚群的识别。其优势是能够形成较持久的CAR表达，主要限制是基因组整合、非目标细胞转导和体内剂量控制。

5.2 腺相关病毒载体

        腺相关病毒可通过衣壳工程调整细胞嗜性，但其包装容量、既往免疫、T细胞转导效率和非目标器官富集会限制应用。重复给药还可能受到中和抗体和细胞免疫反应影响，因此需要同时评价衣壳特异性、组织分布和免疫原性。

5.3 其他工程化病毒载体

        腺病毒、病毒样颗粒及其他工程化载体也可用于递送CAR序列或基因编辑组分。这些平台可在载荷容量、表达持续时间和细胞进入机制方面提供不同选择，但均需评价复制风险、免疫原性、组织分布和规模化制造稳定性。

5.4 脂质纳米颗粒

        脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）可包载CAR mRNA或其他核酸，并通过表面配体提高T细胞靶向性。mRNA释放至胞质后可直接表达CAR，具有不整合基因组和表达可逆的特点。其主要技术瓶颈包括血液稳定性、T细胞摄取、内体逃逸和肝脏等非目标器官分布。

5.5 聚合物和蛋白纳米载体

        聚合物纳米颗粒和蛋白纳米颗粒可通过材料组成、粒径、电荷和配体修饰调节核酸装载与释放。其设计灵活，但材料毒性、降解产物、血液相容性、批次一致性和规模化制造需要系统评价。

5.6 细胞外囊泡递送

        细胞外囊泡具有天然脂质膜结构，可装载mRNA、蛋白质或其他功能分子，并可通过膜蛋白工程增强T细胞识别。其主要限制是载荷装入效率、囊泡异质性、纯化标准和大规模生产。

表1 In vivo CAR-T主要递送系统比较

6 Ex vivo与in vivo CAR-T的技术特征比较

        Ex vivo与in vivo CAR-T的核心差异不是CAR分子本身，而是工程化发生的位置和质量控制对象。Ex vivo路径直接制备并检测回输细胞，in vivo路径则首先控制递送制剂，再由患者体内的转导、表达和细胞扩增形成治疗性CAR-T细胞。

表2 Ex vivo与in vivo CAR-T的技术特征比较

7 In vivo CAR-T的递送效率、功能持续性与安全性挑战

7.1 T细胞靶向特异性

        递送载体必须优先进入目标T细胞，同时避免造血祖细胞、抗原提呈细胞、肝细胞和其他非目标细胞表达CAR。仅检测外周血T细胞中的CAR表达不足以证明特异性，还需评价骨髓、肝脏、脾脏和其他组织中的载体分布及转导细胞类型。

7.2 体内递送效率

        体内递送效率由循环稳定性、靶细胞结合、内吞、内体逃逸、核酸释放和表达共同决定。提高单一环节并不一定提高最终CAR-T细胞数量，例如增强细胞摄取但未改善内体逃逸，仍可能导致大部分核酸在溶酶体中降解。

7.3 非病毒载体的内体逃逸

        LNP和聚合物载体进入T细胞后，载荷需要从内体释放至胞质。增强膜融合或膜破坏能够提高释放效率，但也可能损伤细胞膜、诱导炎症或增加非目标组织毒性，因此需要在递送效率与材料安全性之间取得平衡。

7.4 CAR表达水平与持续时间

        CAR表达过低可能无法形成有效免疫突触，表达过高则可能增加基础信号、细胞衰竭和治疗毒性。mRNA递送产生暂时性表达，便于剂量调节但可能需要重复给药；整合型载体可获得长期表达，却增加插入风险和长期随访要求。

7.5 T细胞亚群选择

        不同T细胞亚群对载体摄取、转导和扩增的能力不同。若载体主要转导高度分化或已经衰竭的T细胞，即使CAR阳性率较高，也可能缺乏持续增殖和长期肿瘤控制能力。递送靶点应兼顾细胞特异性和目标亚群的功能状态。

7.6 免疫原性与载体清除

        病毒包膜、纳米材料、靶向抗体和CAR外源结构均可能诱导先天或适应性免疫反应。载体被快速清除会降低转导效率，产生中和抗体则可能限制重复给药，强烈炎症反应还可能增加全身毒性。

7.7 非目标细胞表达风险

        非目标细胞若表达CAR，可能发生异常抗原识别、组织损伤或长期不可逆改变。整合型载体转导造血祖细胞的风险尤其需要严格控制，因为相关细胞可能长期存在并持续产生CAR阳性后代。

7.8 CRS、ICANS及靶向毒性

        In vivo工程化能够减少体外制造环节，但不会自动消除CRS、ICANS和on-target/off-tumor效应。由于CAR-T细胞可能在体内持续生成，其扩增和毒性动力学可能比单次细胞回输更加复杂，需要建立载体剂量、CAR阳性细胞数量和炎症因子之间的关联。

7.9 可逆控制与安全开关

        短暂mRNA、药物调控型CAR、自杀基因和可降解受体可提高in vivo CAR-T的可控性。安全机制必须在严重毒性发生时快速启动，同时避免过早终止具有治疗作用的CAR-T细胞扩增和持续反应。

7.10 体内质量监测

        In vivo CAR-T无法在治疗前对患者体内生成的CAR-T细胞进行完整检测，因此需要在给药前控制递送制剂的粒径、核酸完整性、包封率、效价、靶向活性和微生物安全，并在给药后持续监测CAR阳性细胞比例、细胞亚群、载体拷贝数、细胞因子和组织分布。

8 CAR-T工程化技术的临床转化与发展方向

8.1 递送制剂的标准化制造

        In vivo CAR-T有望将部分个体化细胞制造转变为可批量生产的基因递送制剂，但载体原料、粒径、载荷量、靶向配体密度和功能效价必须建立明确标准。物理表征一致并不代表体内转导效力一致，仍需建立能够预测T细胞工程化效率的功能检测方法。

8.2 给药剂量与药效学监测

        In vivo CAR-T的剂量应同时考虑载体颗粒数、核酸载荷、目标T细胞转导比例和CAR-T细胞体内扩增。临床监测需要将外周血CAR阳性细胞数量、载体水平、细胞因子和肿瘤负荷进行关联，而不能仅依据递送制剂的给药质量判断有效剂量。

8.3 瞬时与持久表达的分层应用

        短暂mRNA表达适合靶点安全窗口较窄、初始剂量探索或需要快速撤除CAR活性的场景；稳定整合则更适合需要长期免疫监视的疾病。表达持续时间应根据疾病负荷、靶抗原分布和毒性可逆性进行选择。

8.4 逻辑门控与多抗原识别

        多抗原识别和可切换型CAR可扩大靶抗原覆盖范围，降低单一靶抗原丢失导致的免疫逃逸；抑制性CAR主要用于在识别正常组织相关抗原时传递抑制信号，以提高肿瘤识别选择性，其核心功能并非降低抗原逃逸。复杂受体设计需要控制各信号模块的表达比例和激活阈值，避免信号过强引起功能衰竭或因逻辑条件过严降低杀伤效率。

8.5 基因编辑与多载荷递送

        递送系统可同时携带CAR序列、趋化因子受体、免疫抑制抵抗模块或基因编辑组分，以改善组织迁移和功能持续性。多载荷设计会增加载体容量、表达比例和脱靶评价的复杂度，应优先验证每个功能模块是否提供明确的治疗增益。

8.6 实体瘤局部递送

        局部或区域递送可提高载体在肿瘤组织中的暴露，并减少全身非目标转导。该策略适用于部分可直接给药的实体瘤，但需要解决载体在肿瘤内部扩散、局部炎症和工程化T细胞向其他病灶迁移的问题。

8.7 Ex vivo与in vivo路径并行发展

        Ex vivo路径适合需要精确细胞组成、复杂多基因编辑和严格回输前检测的治疗；in vivo路径更适合减少个体化制造、快速给药和可重复剂量调节。两者可能与通用型CAR-T、现场自动化制备和瞬时体内编程共同形成分层技术体系。

8.8 临床转化的评价重点

        In vivo CAR-T的临床转化不仅需要证明能够在体内产生CAR阳性T细胞，还需证明转导细胞类型明确、组织分布可控、CAR表达动力学可预测、严重毒性可终止，并建立长期监测非目标转导和遗传安全性的方案。

9 CAR-T细胞工程化、功能评价与递送研究产品

9.1 CAR-T细胞激活、扩增、转导与保存产品

9.2 CAR信号、T细胞身份与激活状态检测产品

9.3 CAR-T共刺激通路与基因功能研究产品

9.4 In vivo CAR-T靶向特异性与非目标细胞监测产品

        CAR-T工程化正在由可控的体外细胞制造向体内精准递送延伸。Ex vivo路径强调回输细胞的可检测、可筛选和可配比，in vivo路径则强调载体靶向性、组织分布、表达动力学和毒性可逆性。

更多相关文章，详见下方：

[1] 慢病毒与慢病毒载体：从天然病毒到基因递送工具的改造