体外T细胞活化常采用CD3/CD28抗体或PMA/Ionomycin刺激，用于分析TCR信号、细胞增殖、代谢重编程、细胞因子分泌及效应分化。

        关键词：T细胞活化；TCR-CD3；CD28；PMA；Ionomycin；细胞因子；流式细胞术；T细胞耗竭

1 T细胞活化的信号机制

1.1 T细胞活化的三类信号

（1）TCR-CD3信号

        T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别抗原呈递细胞表面的抗原肽-MHC复合物，CD3复合物将信号传递至细胞内。TCR-CD3复合物聚集后，LCK磷酸化CD3和ζ链中的免疫受体酪氨酸活化基序，促进ZAP70募集和激活，随后形成LAT、SLP-76及相关信号蛋白组成的信号复合物。

（2）CD28共刺激信号

        CD28与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86结合，增强PI3K–AKT–mTOR和NF-κB信号，促进IL-2转录、葡萄糖摄取、细胞存活及克隆扩增。TCR信号缺少有效共刺激时，T细胞可能出现低反应状态，难以形成持续增殖和完整效应功能。

（3）细胞因子信号

        活化T细胞分泌IL-2，并通过IL-2受体激活JAK–STAT5信号，促进细胞周期进入和克隆扩增。IL-12、IL-4、IL-6、TGF-β和IL-21等细胞因子可进一步影响CD4⁺ T细胞亚群分化及CD8⁺ T细胞效应功能。

图1 T细胞活化的三类信号模式

1.2 TCR下游信号的协同激活

（1）Ca²⁺–Calcineurin–NFAT通路

        PLCγ1催化PIP₂生成IP₃和DAG。IP₃促进内质网释放Ca²⁺，并诱导细胞膜上的储存操作性钙进入。胞质Ca²⁺升高后，钙调蛋白激活Calcineurin，Calcineurin去磷酸化NFAT并促进其进入细胞核。

（2）DAG–PKCθ–NF-κB通路

        DAG募集并激活PKCθ，进一步促进CARD11、BCL10和MALT1信号复合物形成，最终诱导NF-κB进入细胞核，参与IL-2、细胞存活和炎症相关基因的表达。

（3）RAS–MAPK–AP-1通路

        DAG还可激活RasGRP并启动RAS–RAF–MEK–ERK级联，促进FOS和JUN等转录因子表达并形成AP-1。NFAT、NF-κB和AP-1共同决定多种T细胞活化基因的转录。

1.3 活化后的代谢重编程

        静止T细胞主要依赖氧化磷酸化维持基础能量供应。TCR和CD28信号激活后，T细胞增加葡萄糖摄取、糖酵解、谷氨酰胺利用及脂质合成，为细胞体积增大、蛋白质合成和快速分裂提供能量及生物合成原料。AKT–mTOR信号在该过程中促进葡萄糖转运蛋白表达和合成代谢，AMPK则在能量不足时限制过度合成并维持代谢稳态。

1.4 活化后的增殖与分化

        活化T细胞进入细胞周期并发生克隆扩增。CD4⁺ T细胞可分化为Th1、Th2、Th17和Tfh等亚群；CD8⁺ T细胞可分化为细胞毒性T细胞，通过穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞。抗原清除后，大部分效应细胞发生收缩，部分细胞形成记忆T细胞。

2 T细胞体外活化方法

2.1 CD3/CD28抗体刺激

        抗CD3ε抗体通过交联CD3复合物模拟TCR信号，抗CD28抗体提供共刺激信号。两者可包被于培养板，也可偶联至磁珠。板包被抗体适合分析抗体浓度和信号强度，CD3/CD28磁珠适合持续刺激和大规模细胞扩增。

        CD3/CD28抗体刺激保留LCK、ZAP70、LAT和PLCγ1等TCR近端信号，适用于T细胞增殖、分化、代谢变化、基因表达及CAR-T细胞制备。该方法属于多克隆刺激，不具有特定抗原肽-MHC复合物的抗原选择性。

2.2 PMA/Ionomycin刺激

        PMA模拟DAG，激活PKC和RasGRP相关信号；Ionomycin提高胞质Ca²⁺浓度，激活Calcineurin–NFAT通路。两者联用可绕过TCR-CD3近端信号，直接促进NF-κB、AP-1和NFAT活化。

        PMA/Ionomycin适合诱导细胞因子表达，并可作为NFAT、NF-κB和AP-1相关反应的强刺激阳性对照。该方法绕过TCR-CD3近端信号，且产生的信号和转录程序不同于CD3/CD28刺激，因此不能用于评价T细胞的整体最大应答能力，也不能用于分析CD3、LCK、ZAP70和LAT等近端信号。高浓度或长时间刺激还可能造成细胞死亡、受体内化和非生理性转录反应。

表1 CD3/CD28抗体与PMA/Ionomycin刺激方法比较

3 T细胞活化实验的分组与检测设计

3.1 基础实验分组

（1）未刺激对照组

        细胞仅加入完全培养基，用于确定基础活化标志物、细胞因子和细胞死亡水平。

（2）CD3刺激组

        仅加入抗CD3抗体，用于分析TCR信号在缺少CD28共刺激时的作用。

（3）CD28刺激组

        仅加入抗CD28抗体，用于判断所用抗体是否具有独立激动作用及排除非特异性交联效应。

（4）CD3/CD28联合刺激组

        同时提供TCR信号和共刺激信号，用于诱导完整的T细胞活化和增殖。

（5）PMA/Ionomycin刺激组

        该组作为非受体依赖性强刺激组，用于评价NFAT、NF-κB和AP-1相关反应以及细胞因子产生能力，但不能用于判断全部TCR下游信号是否完整。

3.2 检测时间点

（1）早期信号检测

        刺激后数分钟至数小时可检测LCK、ZAP70、LAT、ERK和AKT磷酸化、Ca²⁺变化及NFAT核转位。该阶段适合研究信号启动，不适合仅以细胞增殖判断活化程度。

（2）早期表型检测

        刺激后数小时至24小时可检测CD69、CD154和部分细胞因子表达。CD25通常在活化后逐渐升高，可用于评价IL-2响应和增殖准备。

（3）增殖和效应检测

        刺激后48～96小时可检测细胞分裂、细胞数量、CD25、ICOS、CD38、HLA-DR及效应细胞因子。培养时间延长时需同步检测细胞活力和培养基营养状态。

（4）持续刺激检测

        持续或重复刺激后可检测PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA-4等抑制性受体，并结合细胞因子、增殖及杀伤功能判断是否出现功能障碍。

3.3 必要实验对照

4 CD3/CD28抗体诱导T细胞活化实验

4.1 细胞提取

（1）取C57BL/6小鼠脾脏，研磨制备单细胞悬液，并通过滤网去除组织碎片。

（2）使用红细胞裂解液处理细胞悬液，收集白细胞并重悬。

4.2 T细胞分选与培养

（1）使用小鼠CD3或CD8细胞分选试剂盒，通过磁性分离方式获得目标T细胞。

（2）使用流式细胞术检测细胞纯度，确保目标细胞纯度达到95%以上。

（3）将细胞培养于含2 mM Glutamine、10% FBS和Penicillin-Streptomycin的RPMI 1640完全培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO₂。

4.3 抗体刺激

（1）在96孔板中包被抗CD3ε抗体145-2C11和抗CD28抗体PV-1，浓度分别为3 µg/mL和1 µg/mL。

（2）以1×10⁵个细胞/孔接种，每孔加入200 μL完全培养基。

（3）在37 ℃、5% CO₂条件下孵育24小时。

（4）收集细胞并使用PBS洗涤，通过流式细胞术检测T细胞活化状态。

4.4 CD3/CD28磁珠刺激

（1）将T细胞调整至所需密度并重悬于完全培养基。

（2）按磁珠与细胞1∶1的比例加入CD3/CD28激活磁珠。

（3）在37 ℃、5% CO₂条件下培养。

（4）检测完成后使用磁力架去除磁珠。

        磁珠持续存在可延长受体刺激时间，适合细胞扩增，但不适合直接替代所有板包被抗体信号研究。

5 PMA/Ionomycin诱导T细胞活化实验

5.1 细胞准备

        细胞提取、分选和培养步骤同第4.1和4.2节。

5.2 PMA和Ionomycin刺激

（1）以2×10⁵个细胞/孔接种于96孔板，每孔加入200 μL完全培养基。

（2）分别加入终浓度为50、100和500 ng/mL的PMA。

（3）各处理组加入终浓度为100 ng/mL的Ionomycin。

（4）空白对照组仅加入完全培养基。

（5）在37 ℃、5% CO₂条件下培养24小时。

（6）收集细胞并使用PBS洗涤。

（7）使用可固定型活死染料标记死细胞，通过流式细胞术检测T细胞活化状态。

5.3 刺激结果评价

        PMA浓度升高可能增强细胞因子表达，也可能增加细胞死亡和应激反应。各浓度组需同时检测细胞活率、CD69或CD25表达及细胞因子水平，区分有效活化与过度刺激。

6 T细胞活化的检测与结果判断

6.1 细胞活力与样品纯度

        活化实验前应检测细胞数量、活率和T细胞纯度。死细胞比例升高可增加抗体非特异性结合并影响细胞因子测定。使用流式细胞术时，应先排除碎片、双联体和死细胞，再分析CD3⁺ T细胞群体。

6.2 活化标志物

        CD69可用于评价早期活化；CD25反映IL-2响应和增殖准备；CD154反映活化CD4⁺ T细胞的辅助功能；ICOS反映共刺激和效应分化状态；CD38和HLA-DR可用于评价持续或较强的免疫活化。CD127在活化后可能暂时下降，需结合培养时间和细胞分化状态解释。

6.3 细胞增殖

        细胞增殖可通过细胞计数、增殖染料稀释、DNA合成检测或细胞周期分析评价。增殖染料可显示细胞分裂代数，但需要结合活死染色排除死亡细胞造成的信号改变。

6.4 细胞因子功能

        IL-2反映早期活化和自分泌增殖信号；IFN-γ和TNF-α反映Th1及细胞毒性T细胞效应功能；IL-17反映Th17相关分化。培养上清可通过ELISA检测，单细胞水平的细胞因子产生可通过胞内细胞因子染色分析。

6.5 细胞毒功能

        CD8⁺ T细胞的细胞毒功能可通过穿孔素、颗粒酶B、CD107a脱颗粒和靶细胞杀伤实验评价。穿孔素和颗粒酶表达升高不一定代表已经发生杀伤，应结合脱颗粒或靶细胞死亡结果判断。

6.6 持续刺激与功能耗竭

        持续刺激可伴随PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA-4表达升高，但这些分子也可在正常活化过程中暂时上调。功能耗竭应同时表现为多个抑制性受体共表达、增殖能力下降、细胞因子分泌减少或靶细胞杀伤能力降低。

表2 T细胞活化与持续刺激的常用评价指标

7 常见实验问题及原因分析

7.1 活化标志物表达较低

        抗体包被不足、抗体失活、细胞纯度较低、细胞活率下降或刺激时间不合适均可导致CD69和CD25上调不足。应检查抗体保存条件、包被步骤、细胞密度及培养基状态，并设置PMA/Ionomycin强刺激对照判断细胞是否仍具有应答能力。

7.2 细胞死亡比例升高

        PMA或Ionomycin浓度过高、刺激时间过长、细胞密度不合适、红细胞裂解过度及培养基营养不足均可增加细胞死亡。应同时比较不同剂量和刺激时间下的活率与活化指标。

7.3 CD69升高但细胞不增殖

        早期活化信号可诱导CD69表达，但持续增殖还需要CD28共刺激、IL-2信号和足够的营养供应。仅有CD3刺激或培养条件不足时，可能出现CD69升高而细胞扩增有限。

7.4 细胞因子升高但表面标志物变化不明显

        PMA/Ionomycin可直接激活胞内转录通路，因此可能明显提高细胞因子表达，却不完全复制受体依赖性的表面标志物变化。此类结果应作为下游功能激活解释，不能直接代表完整的TCR-CD28活化过程。

7.5 抑制性受体表达升高

        PD-1、TIM-3、LAG-3或CTLA-4升高可能反映正常负反馈、持续活化或功能耗竭。需进一步检测细胞增殖、IL-2、IFN-γ、TNF-α及杀伤功能，不能仅根据单个受体表达下结论。

8 T细胞活化、培养与功能检测相关产品

8.1 T细胞分选、刺激与培养产品

8.2 T细胞活化与持续刺激表型检测抗体

8.3 T细胞活化与持续刺激相关检测试剂盒

        CD3/CD28抗体刺激适用于T细胞活化和扩增，PMA/Ionomycin适用于细胞因子诱导和强刺激对照。活化或耗竭状态应结合细胞活力、表面标志物、增殖、细胞因子及杀伤功能判断。

参考文献

[1] De Biasi S, et al. Marked T cell activation, senescence, exhaustion and skewing towards TH17 in patients with COVID-19 pneumonia. Nat Commun. 2020;11(1):3434.

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[3] Ozkazanc D, et al. Functional exhaustion of CD4+ T cells induced by co-stimulatory signals from myeloid leukaemia cells. Immunology. 2016;149(4):460-471.

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[1] T细胞杀伤功能的检测

[2] 杀伤性T细胞介导凋亡通路的识别、效应分子释放与靶细胞死亡机制