功能肽可通过序列和结构设计承担不同的生物学与工程功能。穿膜肽主要用于改善大分子和亲水性货物的细胞摄取与胞内递送；靶向肽通过识别特定受体或组织标志物提高局部富集；自组装肽则通过形成纳米纤维、水凝胶等超分子结构构建局部递送体系和组织支架。三类功能还可通过序列融合、化学偶联或载体组装进行组合，实现靶向识别、细胞内化、载荷递送和材料构建等功能。

        关键词：穿膜肽；细胞穿透肽；靶向肽；自组装肽；TAT；RGD；iRGD；RADA16；肽-药物偶联物；药物递送

1 功能肽的结构基础与分类

1.1 肽的结构、理化性质与功能基础

        肽由氨基酸通过酰胺型肽键依次连接形成，并具有N端和C端。与蛋白质相比，肽链通常较短，但二者不存在统一的链长分界。短肽可形成α-螺旋、β-折叠和β-转角等局部结构。在接近生理pH条件下，Arg和Lys侧链通常带正电，Asp和Glu侧链通常带负电；Leu、Ile、Val等残基具有较强疏水性，Phe、Tyr和Trp含芳香侧链。氨基酸组成、排列顺序和空间构象共同决定肽的净电荷、溶解性、膜亲和性和分子结合界面，环化、末端修饰、D-氨基酸置换及疏水基团连接还可进一步改变肽链柔性、蛋白酶稳定性和受体结合特征。

1.2 穿膜肽、靶向肽与自组装肽的功能差异

        穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）通过肽—膜相互作用促进细胞内化或跨膜转运；靶向肽（targeting peptides）通过特定序列识别细胞膜受体、血管标志物或细胞外基质成分；自组装肽（self-assembling peptides，SAPs）依赖多个肽分子之间的非共价相互作用形成有序超分子结构。靶向肽与受体结合后不一定发生跨膜转运，CPP提高细胞摄取也不意味着具有组织选择性，而自组装描述的是肽分子之间形成高级结构的过程。

2 穿膜肽：膜相互作用与细胞内化机制

2.1 细胞膜屏障与CPP结构基础

        细胞膜以磷脂双层为基本结构，磷脂亲水头部朝向水相，疏水脂肪酸链构成膜内部的低极性区域，带电分子、亲水性大分子、蛋白质和核酸通常难以通过简单扩散跨越这一屏障。CPP可根据理化性质分为阳离子型、两亲型和疏水型等，TAT和多聚精氨酸属于典型阳离子CPP，Penetratin同时含有阳离子和疏水残基，不同CPP对静电作用、疏水作用和局部膜结构重排的依赖程度不同。

2.2 正电荷与两亲性介导膜结合

        Arg侧链的胍基可与磷脂头基、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等细胞表面阴离子组分形成静电作用和多点氢键，使富Arg CPP在细胞表面富集；疏水残基可增强肽与脂质区域的接触，两亲型CPP则可形成相对独立的亲水面和疏水面，使膜表面吸附与脂质相互作用协同发生。正电荷或疏水性过强时，非特异性细胞结合和膜扰动也可能增加。

2.3 内吞与直接跨膜

（1）内吞途径

        CPP可通过能量依赖性内吞进入细胞，细胞膜包裹CPP或CPP—货物复合物并形成膜性囊泡，可涉及大胞饮、网格蛋白依赖性内吞和洞蛋白相关内吞等途径。蛋白质、核酸复合物和纳米颗粒等较大货物通常较多依赖内吞。

（2）直接跨膜

        直接跨膜不形成完整内吞囊泡。CPP在膜表面达到一定局部浓度后可诱导脂质重新排列，瞬时孔道模型涉及短暂水相通道形成，carpet模型涉及肽在膜表面富集后引起脂质排列扰动，倒置胶束模型则涉及脂质头基重新包围肽分子。同一CPP采用何种进入路径可受到肽浓度、细胞类型、膜组成和连接货物影响。

2.4 内体滞留与胞质释放

        经内吞进入细胞的CPP—货物复合物首先位于内体腔，并未直接进入胞质。随着内体酸化并向晚期内体和溶酶体成熟，如果货物不能跨越内体膜，其有效胞质浓度可能明显低于总细胞摄取量。部分膜活性肽可在酸性环境中发生质子化、构象变化或膜亲和性增强，从而促进内体膜扰动和货物释放。对于siRNA、mRNA和胞质作用型蛋白质，内体逃逸通常是决定有效胞质递送的重要步骤。

2.5 CPP与货物的结合方式

        CPP可通过共价偶联连接小分子、肽或蛋白质，也可通过静电或疏水作用形成非共价复合物。DNA和RNA具有带负电的磷酸骨架，可与富含Arg/Lys的CPP发生静电凝聚并形成复合颗粒；连接货物后，体系的粒径、净电荷、疏水性和CPP表面暴露程度均可能改变，因此游离CPP的跨膜行为不能直接代表CPP—货物复合物的递送特征。

3 靶向肽：受体识别与组织归巢

3.1 靶向肽的分子识别基础

        靶向肽通过特定氨基酸侧链构成受体结合界面，可识别细胞膜蛋白、血管标志物或细胞外基质成分，结合过程通常由空间形状互补、氢键、静电作用和疏水作用共同维持。靶向序列可来源于天然配体功能区域，也可通过噬菌体展示等方法筛选获得；关键残基的位置变化、环化或侧链修饰均可能改变受体结合能力。

        RGD由Arg-Gly-Asp组成，是纤连蛋白、玻连蛋白等细胞外基质蛋白中的经典细胞黏附基序。其主要受体为整合素（integrins），后者由α和β两个跨膜亚基组成，胞外区域结合细胞外基质，胞内区域连接细胞骨架和信号蛋白。αvβ3、αvβ5、α5β1等多种整合素能够识别RGD，但不同RGD衍生物对各亚型的亲和力和选择性存在差异；环状RGD通过限制肽链构象，可使关键残基保持相对固定的空间排列。RGD还可通过增加邻近残基或连接功能基团形成RGDS、GRGDS、cyclo(RGDfK)等衍生物，改变构象稳定性、受体结合和材料偶联方式。

3.3 NGR与CD13识别

        NGR由Asn-Gly-Arg组成，部分NGR肽可识别肿瘤新生血管相关氨肽酶N（aminopeptidase N，APN/CD13）。CD13在多种正常细胞中也有表达，因此NGR归巢还受到CD13分子状态、血管环境及靶点可及性影响。NGR中的Asn可发生脱酰胺并形成isoDGR，改变肽骨架连接和空间构象，isoDGR还可与部分整合素相互作用。

3.4 iRGD的顺序性组织穿透机制

        iRGD包含RGD基序和潜在的C-end Rule（CendR）基序。完整iRGD首先通过RGD区域结合肿瘤相关αv整合素，随后经蛋白水解使原先位于肽链内部的R/KXXR/K型CendR基序暴露于新的C末端；暴露后的CendR基序进一步结合neuropilin-1（NRP1），启动内化和组织穿透。这一过程依次经历整合素归巢、蛋白水解、CendR基序暴露和NRP1介导穿透，顺序性受体识别是iRGD区别于普通RGD靶向肽的重要特征。

3.5 RVG与神经系统靶向递送

        来源于狂犬病毒糖蛋白的RVG衍生肽具有神经系统相关靶向和递送特征。RVG29可用于构建脑靶向递送体系，其末端连接Cys后可提供巯基偶联位点；RVG-9R进一步引入多聚Arg，可通过静电作用结合带负电的核酸，同时增强细胞摄取。RVG来源肽与siRNA等核酸货物组合后，可将靶向识别、核酸结合和神经系统递送整合于同一体系。

3.6 受体亲和力与组织靶向效率

（1）靶点可及性

        靶向效率不仅受到结合亲和力影响，还取决于受体密度、空间位置及内化特征。位于血管腔面的受体可直接接触循环中的肽，而位于组织深部细胞表面的受体需要肽先跨越血管内皮和组织间质。

（2）多价结合

        肽连接至纳米载体后可产生多价效应，使同一颗粒表面的多个配体同时或连续参与受体结合。配体密度、空间间隔及基序暴露程度均会影响这种作用，因此游离肽亲和力不能直接替代肽修饰载体的组织靶向性能。

4 自组装肽：分子组装与超分子结构形成

4.1 自组装过程与非共价驱动力

        肽自组装是多个肽分子依靠非共价相互作用形成有序高级结构的过程，可经历单体肽、二级结构或初级聚集体、纳米结构和三维网络等不同层级。肽骨架羰基和N—H之间可形成氢键，疏水侧链倾向于聚集，带相反电荷的残基可产生静电吸引，Phe、Tyr和Trp等芳香残基还可参与芳香相互作用，这些作用共同影响纳米纤维、纳米管、胶束及水凝胶等结构的形成。

4.2 β-折叠与纳米纤维形成

        β-折叠由相邻肽链或链段之间规则排列的骨架氢键稳定。肽链处于延伸构象时，羰基和N—H沿特定方向连续配对形成片层；当这一排列继续延伸并发生侧向堆积时，可形成一维纳米纤维。β-折叠是多类纤维型自组装肽的重要结构基础，但并非所有自组装体系均依赖相同的β-折叠路径。

4.3 RADA16的离子互补型组装

        RADA16由Arg-Ala-Asp-Ala重复单元构成，Arg带正电、Asp带负电、Ala具有疏水性，使肽链能够形成具有亲水面和疏水面的β-折叠结构。肽骨架氢键、疏水作用和电荷相互作用促进分子有序排列并形成纳米纤维，纳米纤维进一步缠结和物理交联后形成高含水量三维网络。宏观水凝胶性能还取决于纤维长度、连接密度和网络结构，因此形成β-折叠或纳米纤维并不等同于已经形成具有稳定材料性能的水凝胶。

4.4 FF及芳香短肽的有序组装

        二苯丙氨酸（diphenylalanine，Phe-Phe，FF）由两个Phe组成，Phe侧链之间的芳香相互作用与肽骨架氢键共同促进分子有序排列，在不同条件下可形成纳米管、纳米纤维等结构。N端引入Z、Fmoc等芳香保护基后，可进一步改变疏水界面和芳香相互作用，进而调控聚集形态和超分子结构。

4.5 肽两亲分子的组装

        肽两亲分子（peptide amphiphiles，PAs）通常由疏水烷基尾部和亲水肽段组成。在水相中，疏水尾部聚集于结构内部，亲水肽段暴露于水相，肽段之间进一步形成氢键或β-折叠并促进纳米纤维形成；受体结合、细胞黏附等功能基序还可设置于亲水端并排列在纤维表面。

4.6 环境因素对组装平衡的调控

        pH能够改变Asp、Glu、Lys等可电离残基的质子化状态，进而影响静电吸引或排斥；盐离子可屏蔽静电作用；肽浓度则影响成核、纤维延伸和纤维间缠结。同一肽序列在不同pH、离子强度和浓度条件下可形成不同尺寸、形态或网络密度的聚集结构。

5 三类功能肽的工程整合

5.1 靶向肽与CPP的串联

        靶向肽负责受体识别和局部富集，CPP促进膜结合和细胞内化，两类模块连接后可将靶点识别与胞内递送整合在同一分子体系中。强阳离子CPP持续暴露可能增加非靶细胞膜结合，因此部分设计采用蛋白酶敏感连接序列、pH响应结构或可脱除屏蔽基团，在特定微环境中恢复CPP的膜活性。

5.2 靶向肽与纳米载体的多价展示

        靶向肽连接在脂质体、脂质纳米颗粒或其他纳米载体表面后，同一颗粒可同时展示多个配体并形成多价结合。实际效果取决于配体密度、PEG间隔臂长度和靶向基序是否暴露在颗粒外表面；如果肽在组装过程中被埋入载体或受到空间位阻，其游离状态下的高亲和力并不能直接转化为有效细胞靶向。

5.3 CPP与核酸复合物的形成

        DNA、siRNA和mRNA的磷酸骨架带有高密度负电荷，富含Arg或Lys的CPP可通过静电作用与其形成纳米复合物。CPP在此过程中同时承担核酸凝聚和膜结合功能，但过度凝聚可能降低核酸释放效率，因此实际递送需要同时兼顾复合物稳定性、细胞摄取和胞内解离。

6 功能肽的实际递送与材料应用

6.1 靶向治疗型环肽：Cilengitide

        Cilengitide是含RGD基序的环状五肽，可结合αvβ3和αvβ5整合素并抑制整合素介导的细胞黏附及相关信号。与仅作为载体靶向模块的肽不同，Cilengitide的环肽结构本身同时承担靶点识别和药理抑制功能。该分子曾进入胶质母细胞瘤临床研究，早期研究观察到一定抗肿瘤活性，但后续Ⅲ期研究未显示在标准治疗基础上进一步改善生存，最终未实现上市转化。Cilengitide由此成为RGD靶向肽直接发展为药理活性分子的代表性实例，也体现了受体亲和力与最终临床疗效之间并非简单对应关系。

6.2 肽-药物偶联物：ANG1005跨血脑屏障递送

        ANG1005是典型肽-药物偶联物（peptide-drug conjugate，PDC），由脑靶向肽Angiopep-2与多个紫杉醇分子共价连接形成。Angiopep-2利用低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）相关转运系统促进跨血脑屏障和脑肿瘤组织进入，紫杉醇作为药物载荷发挥微管稳定和细胞毒作用，连接结构则维持肽与药物的偶联并允许载荷释放。ANG1005已进入临床研究，并在乳腺癌脑转移及软脑膜转移患者中观察到颅内抗肿瘤活性，是将脑靶向肽、连接结构和细胞毒药物组合为PDC的代表性实例。

6.3 肽-放射性核素偶联：¹⁷⁷Lu-DOTATATE

        ¹⁷⁷Lu-DOTATATE是已经实现临床转化的肽受体放射性核素治疗（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）体系。其靶向部分为生长抑素类似肽octreotate，可识别部分神经内分泌肿瘤高表达的生长抑素受体，尤其是SSTR2；DOTA作为螯合基团稳定结合放射性核素¹⁷⁷Lu。复合物在受体阳性肿瘤组织中富集并发生受体介导内化后，¹⁷⁷Lu产生的β射线对肿瘤细胞造成辐射损伤。该体系已获批用于特定生长抑素受体阳性神经内分泌肿瘤，是靶向肽介导放射性核素定位和治疗的代表性临床应用。

6.4 RVG-Cys修饰脂质载体的构建

        RVG-Cys末端Cys中的巯基可与maleimide活性基团发生选择性加成，例如与DSPE-PEG-maleimide偶联形成RVG-PEG-DSPE，再通过共组装或后插入方式将该功能脂质引入脂质体，使RVG序列暴露于颗粒外表面。此时RVG承担神经系统相关靶向和细胞识别功能，脂质双层负责包载并保护小分子药物、蛋白质或核酸，PEG间隔臂有助于提高肽基序的表面可及性。对于siRNA和mRNA等胞质作用货物，颗粒完成靶向和内吞后仍需进一步实现内体逃逸和核酸释放，因此该体系能够具体体现靶向肽、偶联结构和纳米载体之间的功能分工。

6.5 RADA16自组装水凝胶：局部递送与组织修复

        RADA16在适宜环境中可形成β-折叠纳米纤维，纳米纤维进一步缠结和物理交联后形成三维水凝胶网络。该网络能够构建类似细胞外基质（ECM）的局部三维环境，为细胞迁移和组织修复提供支架，同时可包载蛋白质、生长因子或小分子，使货物释放受到网络孔径、肽—货物相互作用和水凝胶结构变化共同调控。RADA16相关自组装肽材料已经进入实际止血应用，同时也被用于创面修复、组织工程和局部药物递送研究，使自组装肽从分子组装研究延伸到可实际使用的生物材料体系。

7 产品

7.1 穿膜、靶向与递送相关功能肽

7.2 自组装相关短肽与聚集模型产品

7.3 靶点验证与功能化相关产品

参考文献

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主要缩写

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