KRAS G12D是胰腺癌、结直肠癌和肺癌等实体瘤中的重要驱动突变。MRTX1133等分子的出现证明了KRAS G12D可以被直接药理干预，而PROTAC等靶向蛋白降解技术进一步将作用模式从“占据并抑制KRAS”推进到“募集E3连接酶并清除KRAS蛋白”。

        关键词：KRAS G12D；MRTX1133；RAS；PROTAC；靶向蛋白降解；ASP3082；VHL；CRBN；泛素–蛋白酶体系统

1 KRAS G12D的分子基础

1.1 KRAS的GDP/GTP分子开关

（1）GDP与GTP状态

        KRAS属于RAS小GTP酶家族，可在GDP结合的低活性状态和GTP结合的活性状态之间转换。GTP结合后，Switch I和Switch II区域发生构象变化，使KRAS能够募集RAF、PI3K、RalGDS等效应蛋白。

（2）GEF与GAP调节

        SOS1等鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）促进GDP释放和GTP装载，使KRAS进入活化状态；NF1等GTPase激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）促进GTP水解，使KRAS回到GDP结合状态。

（3）G12D突变

        KRAS G12D由第12位甘氨酸突变为天冬氨酸。该位置位于核苷酸结合和GTP水解调节区域附近，突变可削弱GAP促进的GTP水解，使KRAS更倾向维持活化状态，并持续驱动RAF–MEK–ERK和PI3K–AKT等信号。

1.2 KRAS G12D为何长期难以直接靶向

（1）缺少可利用的突变半胱氨酸

        KRAS G12C的药物开发可利用突变产生的Cys12建立共价结合，而G12D产生的是带负电荷的Asp12，无法直接复制G12C的共价抑制策略。

（2）核苷酸位点难以竞争

        KRAS对GDP和GTP具有很高亲和力，细胞内鸟嘌呤核苷酸浓度也较高。直接竞争GDP/GTP结合位点难以同时满足亲和力和选择性要求。

（3）Switch区域高度动态

        GDP/GTP转换伴随Switch I和Switch II构象持续变化。同一种KRAS突变在不同核苷酸状态下可以形成不同药物结合环境，使药物设计不仅需要考虑突变选择性，还需要考虑构象选择性。

1.3 KRAS G12D驱动的下游信号

（1）RAF–MEK–ERK

        活化KRAS募集RAF家族蛋白，启动RAF–MEK–ERK级联。ERK进一步调节MYC、ELK1等转录程序，促进细胞周期进入、增殖及生存。

（2）PI3K–AKT

        KRAS还可与PI3K发生功能连接，提高PIP3生成并促进AKT相关信号，参与代谢适应、蛋白合成和抗凋亡。

（3）信号网络而非单一路径

        KRAS G12D肿瘤并不完全依赖单一MAPK输出。RTK、SHP2、SOS1、野生型RAS及PI3K–AKT均可能参与反馈补偿，这也是直接抑制和靶向降解都需要面对的耐药基础。

2 KRAS G12D如何实现直接抑制

2.1 MRTX1133建立非共价直接抑制范式

（1）Switch-II相关口袋识别

        MRTX1133是KRAS G12D直接抑制研究中的代表性分子。其通过非共价方式高亲和识别KRAS G12D的Switch-II相关口袋，并利用Asp12及周围结构形成突变选择性。

（2）限制核苷酸交换

        MRTX1133结合KRAS G12D后，可降低SOS1促进的核苷酸交换，使KRAS重新进入GTP活化状态的效率下降。

（3）阻断效应蛋白信号

        KRAS G12D受到占据后，与RAF等效应蛋白的功能连接受到限制，进一步降低MEK和ERK信号输出。

2.2 从单一构象抑制向多状态KRAS控制扩展

（1）GDP状态不是唯一药物入口

        G12D突变提高KRAS活性状态比例。如果药物高度依赖GDP状态，SOS1活性和核苷酸循环速度可能改变药物可结合的KRAS比例。

（2）RAS(ON)策略

        针对GTP结合活性RAS的抑制策略进一步将药物作用范围扩展至RAS(ON)状态。此类药物的终点仍然是限制KRAS与下游效应蛋白的功能连接，而不是降低KRAS蛋白本身。

（3）抑制与降解需要区分

        即使某些直接抑制剂依赖多组分复合物形成，只要没有发生E3连接酶依赖的泛素化和KRAS蛋白清除，就不能定义为靶向蛋白降解。

2.3 直接抑制的主要限制

（1）占位依赖

        传统抑制剂主要遵循占位驱动（occupancy-driven）药理模式。只有足够比例的KRAS持续被药物占据，才能维持稳定的信号抑制。

（2）RTK–SHP2–SOS1反馈

        ERK受到抑制后，原有负反馈可解除，使EGFR等RTK重新增强，并通过SHP2和SOS1增加RAS活化输入。

（3）旁路信号补偿

        MAPK信号受到抑制后，PI3K–AKT等平行生存通路可能增强，使初始的p-ERK下降不能完全转化为持续的肿瘤抑制。

（4）结合位点耐药

        直接抑制高度依赖KRAS与药物之间的稳定结合。Switch区域或邻近残基发生二次改变后，可能降低药物亲和力并形成耐药。

3 为什么从直接抑制进一步走向靶向降解

3.1 从占位驱动转向事件驱动

        直接抑制可以概括为：

        KRAS G12D + 抑制剂 → KRAS功能受阻

        PROTAC型靶向降解则形成：

        KRAS G12D + 降解剂 + E3连接酶 → 三元复合物 → KRAS泛素化 → 蛋白酶体降解

        两者最大的差异在于，直接抑制主要改变KRAS的功能状态，降解则直接降低细胞内KRAS蛋白丰度。

3.2 KRAS G12D PROTAC的三个基本模块

（1）KRAS结合端

        KRAS结合端负责识别G12D突变蛋白。MRTX1133等高亲和G12D结合骨架的建立，为后续PROTAC设计提供了可利用的warhead。

（2）E3连接酶结合端

        VHL和CRBN是靶向蛋白降解研究中常用的E3募集系统。E3配体不仅决定募集哪种连接酶，还会改变三元复合物形成方式和组织背景下的降解能力。

（3）Linker

        Linker连接KRAS配体与E3配体。长度、柔性、极性和连接位点共同决定KRAS与E3之间的空间取向，也会明显影响细胞通透性。

3.3 三元复合物是降解效率的核心

（1）二元亲和力不足以预测降解

        高亲和KRAS配体连接E3配体后，并不一定产生高效降解。如果KRAS与E3之间的空间排列不利于泛素转移，即使两端均能结合也可能没有明显降解。

（2）协同性

        KRAS、PROTAC和E3可形成新的蛋白–蛋白界面。三元复合物具有正协同性时，可提高复合物稳定性和有效泛素化概率。

（3）赖氨酸空间可及性

        泛素需要转移到KRAS表面的赖氨酸残基。三元复合物必须使适合的赖氨酸进入E2–E3催化空间，才能产生生产性泛素化。

3.4 靶向降解带来的药理变化

（1）KRAS总蛋白降低

        直接抑制通常不明显改变KRAS总蛋白，而降解剂的核心药效终点就是KRAS蛋白下降。

（2）同时移除多层功能

        KRAS既具有GTPase功能，也是RAF、PI3K等效应蛋白的结合平台。蛋白降解可同时减少这些功能。

（3）药效可超过瞬时占位

        KRAS被清除后需要重新合成才能恢复蛋白丰度。药物撤除后，KRAS蛋白恢复可能滞后于胞外药物清除。

（4）并不会自动消除所有耐药

        PROTAC仍需要KRAS结合端识别靶蛋白。能够破坏warhead结合的KRAS二次突变仍可能产生降解耐药。

4 KRAS G12D靶向降解如何建立

4.1 从直接抑制剂转化为降解warhead

（1）寻找溶剂暴露位点

        直接抑制剂转化为PROTAC时，需要在不明显影响KRAS结合的区域安装linker。连接位点选择错误可能直接破坏原有亲和力。

（2）连接E3配体

        KRAS warhead与VHL或CRBN配体连接后，分子由单纯的KRAS占位剂转变为能够同时结合靶蛋白和E3连接酶的双功能分子。

（3）重新建立SAR

        PROTAC不能直接继承母体抑制剂的构效关系。需要重新评价KRAS结合、E3结合、三元复合物稳定性、细胞通透性、DC50和Dmax。

4.2 VHL型KRAS G12D降解

（1）VHL募集

        VHL型PROTAC将KRAS G12D配体与VHL配体连接，使KRAS靠近CRL2^VHL泛素连接酶复合物。

（2）KRAS泛素化

        形成生产性三元复合物后，KRAS表面赖氨酸获得泛素修饰，随后形成适合蛋白酶体识别的多聚泛素链。

（3）蛋白酶体清除

        多聚泛素化KRAS被26S蛋白酶体识别并降解，使总KRAS G12D水平下降，下游MAPK信号随之受到持续抑制。

4.3 setidegrasib（ASP3082）代表的临床阶段降解策略

（1）KRAS G12D–E3三元复合物

        ASP3082是KRAS G12D靶向降解的重要代表，其药理核心并不是简单提高KRAS结合亲和力，而是建立稳定、生产性的KRAS G12D–降解剂–VHL三元复合物。

（2）从亲和力优化转向复合物优化

        传统小分子SAR通常重点关注KD、IC50和细胞活性，而降解剂还需要关注三元复合物形成、协同性、泛素化效率、DC50、Dmax和降解持续时间。

（3）从概念验证进入临床开发

        ASP3082现名setidegrasib，已将KRAS G12D靶向降解从临床概念验证推进至Ⅲ期注册性研究。其Ⅰ期研究已在患者中证实KRAS G12D靶蛋白降解及抗肿瘤活性，进一步证明突变KRAS可作为泛素–蛋白酶体系统的人工底物被主动清除。

（1）CRBN

        CRBN是另一类成熟的PROTAC E3募集系统。以IMiD类骨架为基础的CRBN配体具有成熟的化学修饰位点，可构建不同linker长度的KRAS降解剂。

（2）不同E3并不能直接互换

        将相同KRAS warhead从VHL体系换成CRBN体系后，三元复合物几何结构会发生明显变化，降解能力可能提高，也可能完全消失。

（3）组织表达需要考虑

        不同E3连接酶在肿瘤和正常组织中的表达存在差异。未来KRAS G12D降解剂的选择性不仅来自KRAS结合端，也可能受到E3组织分布影响。

5 KRAS G12D靶向后的耐药与联合干预

5.1 RTK–SHP2–SOS1反馈

（1）RTK反馈增强

        KRAS–ERK受到抑制后，ERK相关负反馈解除，使EGFR等受体酪氨酸激酶重新增加上游信号输入。

（2）SHP2重新连接RTK与RAS

        SHP2参与多种RTK向RAS传递信号。SHP2增强可以提高GRB2–SOS1相关输入，并促进残余RAS重新活化。

（3）SOS1提高GTP装载

        SOS1促进RAS由GDP状态向GTP状态转换。抑制SOS1可降低RAS-GTP形成，并减少直接抑制或降解后出现的上游反馈。

5.2 MAPK和PI3K–AKT补偿

（1）ERK反弹

        治疗早期p-ERK下降并不意味着MAPK被长期关闭。RTK反馈、RAS旁系蛋白或RAF–MEK节点改变均可能导致ERK重新活化。

（2）AKT补偿

        部分细胞可通过增强PI3K–AKT维持生存，即使MAPK仍处于较低水平也可形成药物耐受。

（3）联合策略需要机制证据

        联合MEK、ERK、SHP2、SOS1或PI3K抑制剂前，应先确认相应反馈或旁路确实在KRAS G12D干预后增强。

5.3 降解剂特有耐药

（1）E3连接酶改变

        VHL、CRBN或其复合物组分表达下降，可降低三元复合物向有效泛素化转化的效率。

（2）三元复合物界面改变

        KRAS或E3表面发生改变时，降解剂仍可能保持二元结合，却无法形成稳定的生产性三元复合物。

（3）泛素化效率下降

        KRAS表面可接受泛素的赖氨酸空间可及性变化，也可能造成“结合正常但降解不足”。

（4）蛋白重新合成

        KRAS被降解后，转录和翻译补偿可能加速蛋白恢复。降解速度和恢复速度需要同时纳入药效评价。

6 如何实验判定直接抑制与靶向降解

6.1 首先确认KRAS G12D模型

（1）突变背景

        首先确认细胞、类器官或肿瘤组织携带KRAS G12D，并根据研究目的加入KRAS WT、G12C、G12V、G13D等对照。

（2）KRAS总蛋白

        KRAS总蛋白反映蛋白丰度，是区分直接抑制和靶向降解的核心指标。

（3）RAS-GTP

        RAS-GTP反映RAS活化状态。RAS-GTP降低只能证明活化受到抑制，不能直接证明KRAS发生降解。

6.2 直接抑制的证据链

（1）靶点结合

        可通过SPR、ITC、CETSA或细胞内靶点结合体系评价候选分子与KRAS G12D的直接作用。

（2）功能阻断

        检测RAS-GTP、KRAS–RAF相互作用、p-MEK和p-ERK，建立KRAS结合与下游信号抑制之间的关系。

（3）总蛋白保持

        如果KRAS总蛋白基本稳定，而RAS-GTP和p-ERK明显下降，更符合直接功能抑制。

6.3 降解必须同时评价DC50和Dmax

（1）DC50

        DC50表示达到50%最大降解效应时所需的降解剂浓度，其含义不同于传统抑制剂IC50。

（2）Dmax

        Dmax表示实验条件下能够达到的最大蛋白降解比例。低DC50并不等于能够完全清除KRAS。

（3）时间动力学

        应记录KRAS开始下降、达到最大降解以及后续恢复的时间过程，而不能只观察单一终点。

（4）Washout

        撤除降解剂后继续监测KRAS和p-ERK，可分析靶蛋白重新合成速度及降解产生的药效持续性。

6.4 泛素–蛋白酶体机制归因

（1）KRAS mRNA

        KRAS蛋白下降时应同步检测KRAS mRNA。mRNA基本稳定而蛋白快速下降，更支持转录后蛋白稳态改变。

（2）泛素化

        免疫沉淀KRAS后检测泛素化增加，可以将三元复合物形成与后续靶蛋白处理连接起来。

（3）蛋白酶体救援

        MG-132等蛋白酶体抑制剂能够恢复KRAS蛋白时，可支持蛋白酶体参与降解过程。

（4）E3连接酶依赖

        VHL或CRBN竞争、遗传敲低以及失去E3结合能力的阴性分子均可判断降解是否依赖相应E3。

（5）Cullin-RING依赖

        VHL和CRBN分别属于Cullin-RING E3系统。抑制NEDD8活化可进一步判断Cullin E3是否参与降解。

6.5 突变选择性与脱靶评价

（1）不同KRAS突变

        至少比较G12D与WT，并可加入G12C、G12V、G13D及Q61H等突变蛋白或细胞背景。

（2）RAS旁系蛋白

        HRAS和NRAS不应在高选择性G12D降解条件下出现明显同步下降，否则需要考虑warhead或三元复合物选择性不足。

（3）蛋白组学

        蛋白组学可以评价降解剂是否引起非预期蛋白下降，是高质量PROTAC选择性研究的重要补充。

6.6 功能终点

（1）MAPK输出

        p-MEK和p-ERK反映KRAS下游信号强度，但必须与KRAS总蛋白变化联合分析。

（2）细胞增殖与存活

        细胞活力、克隆形成和长期增殖可评价靶蛋白干预后的功能结果。

（3）体内药效

        动物模型中应同时记录肿瘤抑制、肿瘤组织KRAS降解深度及p-ERK变化，而不是只根据肿瘤体积判断降解机制。

7 产品

7.1 KRAS G12D靶蛋白、遗传与检测产品

7.2 KRAS G12D直接抑制研究产品

7.3 KRAS G12D及比较性靶向降解产品

7.4 E3连接酶与泛素–蛋白酶体研究产品

7.5 SOS1–KRAS及pan-KRAS研究产品

        KRAS G12D药物开发已经从突变蛋白的直接占位抑制扩展到E3连接酶介导的蛋白清除。靶向降解增加了KRAS蛋白丰度这一新的药理控制维度，但其优势仍取决于三元复合物形成、降解选择性、反馈耐药及治疗窗口。

参考文献

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[1] KRAS抑制剂——不可成药靶点”？已是历史

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