引言

         药物分子与蛋白质的结合发生在水环境中。结合之前，药物表面的羟基、羰基、醚氧和杂环氮等极性基团与周围水分子相互作用，蛋白结合位点内部也可能存在位置和稳定性不同的水分子。药物进入结合位点后，一部分水被排回溶液，一部分继续保留，还有一些水停留在药物与蛋白之间，同时与两者形成氢键。[1-3]

         2025年解析的人源共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白激酶（ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase，ATR）与Camonsertib（RP-3500）复合物结构中，研究者在药物结合区域建立了两个结合水模型：一个与Camonsertib的叔醇相连，另一个位于氧杂双环氧原子与ATR的Ser2305之间。[1] 这一结构把“药物借助水与蛋白连接”落实到了具体的官能团和三维位置。

1. 蛋白结合位点中的水分子

1.1 药物进入的不是一个空的结合口袋

         蛋白处于水溶液中，其表面和部分内部空腔原本就与水接触。药物进入结合位点之前，蛋白极性基团可能已经与水形成氢键；药物自身的极性基团也处于水合状态。

药物结合会同时改变三类相互作用：

         药物—水、蛋白—水和水—水之间的原有作用发生重新排列，同时建立新的药物—蛋白直接作用或水介导作用。[2-4]

1.2 结合水和有序水具有相对明确的位置

         高分辨率蛋白—配体结构中，一些水能够在特定位置建立结构模型。这类水通常称为结合水（bound water）或有序水（ordered water）。

         它们往往位于蛋白极性基团、药物官能团或者其他水分子之间，并形成相对完整的局部氢键网络。

结构数据能够提供的信息主要是：

         水位于哪里，以及它与周围哪些原子具有合理的相互作用几何关系。

         一个水在结构中位置明确，并不意味着保留它一定能够提高亲和力；同样，排出一个水也不意味着结合一定增强。[2-4]

2. 水介导氢键的几何基础

2.1 水同时具有氢键供体和受体性质

         水分子的氧原子具有孤对电子，在常见的蛋白—配体体系中可以作为氢键受体；O—H中的氢则可以作为氢键供体。因此，一分子水能够与周围多个极性基团形成氢键，并参与局部氢键网络。[6]

蛋白与药物直接形成氢键时，可以简化表示为：

         蛋白–D–H ··· A–药物

         其中，D–H表示氢键供体，A表示氢键受体。实际体系中，氢键供体也可以位于药物一侧、受体位于蛋白一侧。

当水分子位于蛋白与药物之间时，水可以分别与两侧的极性基团形成氢键，构成水介导氢键。例如，在一种常见的供体—水—受体连接方式中，可以表示为：

         蛋白–D–H ··· O(H₂O)–H ··· A–药物

         此时，水在靠近蛋白的一侧作为氢键受体，在靠近药物的一侧作为氢键供体。根据蛋白和药物官能团的供受体性质，水也可以采用其他氢键连接方式。

         因此，直接氢键由蛋白和药物的官能团直接建立极性接触，而水介导氢键中至少有一个水分子参与蛋白与药物之间的局部氢键网络。两种作用方式可以在同一蛋白—药物复合物中同时存在。

2.2 水桥能够补偿距离和方向差异

         氢键具有明确的距离和方向要求。药物结构中存在氧、氮或羟基，并不意味着这些官能团进入蛋白后自然就能形成有效氢键。

         例如，蛋白中的羟基与药物中的醚氧虽然都具有形成氢键的条件，但如果二者相距较远，或者空间取向不合适，直接相互作用可能较弱：

当一个水分子位于两者之间时：

         蛋白–OH ··· H₂O ··· O–药物

         水分子较小，并且具有多个可能的氢键取向，可以补偿部分距离和方向差异，使两个极性区域形成连续的相互作用网络。[2,3]

         因此，水介导氢键的作用是把原本难以直接连接的两个极性区域组织成合适的三维氢键网络。

3. 结合水与蛋白—药物结合自由能

3.1 药物形成新氢键之前需要改变原有溶剂化作用

药物中的羟基在游离状态下可能已经和水形成氢键：

         药物–OH ··· H₂O

进入蛋白以后，它可能转变为：

         药物–OH ··· 蛋白

也可能保持水作为中间连接：

         药物–OH ··· H₂O ··· 蛋白

         极性基团从水环境进入蛋白结合位点时，会失去部分原有的水合作用，这一过程称为脱溶剂化（desolvation）。

         如果新的蛋白—药物作用或水介导作用无法充分补偿脱溶剂化代价，增加一个极性官能团并不一定有利于结合。[2-4]

         这也是药物化学中常见的一种现象：二维结构只增加一个氧或氮，活性却可能提高、基本不变，也可能明显下降。

3.2 焓和熵共同决定结合水的实际作用

蛋白—配体结合自由能由焓和熵共同决定，可表示为：

         ΔG_bind = ΔH_bind − TΔS_bind

         其中，ΔG_bind 为结合自由能，ΔH_bind 为结合焓变，ΔS_bind 为结合熵变，T 为绝对温度。

         一个结合水如果同时与蛋白和药物形成良好的氢键，可以带来有利的相互作用；另一方面，与体相水相比，位于较固定结合位点的有序水通常具有更受限的平移和转动自由度。

         把一个结合水排回体相溶液，也同时产生两方面变化：水获得更大的运动自由度，但原先的蛋白—水、药物—水或水—水相互作用也可能被破坏。[2-4]

         Matricon等的研究进一步显示，水置换带来的结合变化可以具有明显的焓驱动特征，而且扰动一个水位点还可能影响附近整个水合网络。[2]

4. Camonsertib–ATR复合物中的两个结合水

         Camonsertib（RP-3500）是一种ATR抑制剂。Wang等于2025年解析了人ATR与ATR相互作用蛋白（ATR-interacting protein，ATRIP）复合物结合RP-3500的冷冻电镜结构。RP-3500复合物整体重构分辨率为3.79 Å，活性位点所在催化核心的局部分辨率接近3 Å，为RP-3500结合方式及局部结合水的结构分析提供了基础。[1]

         RP-3500位于ATR的ATP结合位点。研究者在药物附近建立了两个结合水模型，分别标记为w1和w2。两个水连接RP-3500不同的含氧官能团与ATR局部结构，形成两组水介导氢键。[1]

图1 Camonsertib（RP-3500）在ATR活性位点中的结合方式及两个结合水

图中绿色棒状结构为RP-3500，深灰色结构为邻近ATR残基，青色虚线表示氢键。

         ①a、b： 从两个方向显示RP-3500在ATR活性位点中的三维位置；

         ②c： 以二维形式表示RP-3500与周围残基的主要相互作用；

         ③d： 放大两个结合水w1和w2所在区域。红色球表示结合水，w1位于RP-3500叔醇附近，w2位于氧杂双环氧与S2305之间。[1]

         图片来源： Wang G. et al. Science Bulletin, 2025, 70, 2137–2146, 原论文Fig. 4，期刊页码2143。CC BY 4.0许可。[1]

4.1 叔醇–w1–催化环水介导氢键

         Camonsertib含有一个叔醇羟基。结合水w1位于该羟基与ATR催化环之间。叔醇羟基与w1形成氢键，w1同时与L2482所在催化环区域形成氢键。[1]

其局部连接关系为：

         Camonsertib–OH ··· H₂O(w1) ··· ATR催化环

         L2482为亮氨酸，其侧链为疏水烷基。这里的水介导氢键涉及L2482所在肽链的主链区域。[1] 原论文还指出，叔醇附近的这一水分子也见于RP-3500一水合物的单晶X射线结构。[1]

         w1使Camonsertib的叔醇通过一分子水与ATR催化环形成连续的极性连接。

4.2 氧杂双环氧–w2–S2305水介导氢键

         Camonsertib还含有氧杂双环结构，其中的醚氧可以作为氢键受体。

         结合水w2位于该醚氧与ATR丝氨酸2305（Ser2305，S2305）之间。原始研究显示，w2同时与S2305羟基和氧杂双环氧形成氢键。[1]

其局部连接关系为：

         Ser2305–OH ··· H₂O(w2) ··· O–Camonsertib

         这一结构使氧杂双环中的醚氧通过w2与S2305建立极性连接。

Camonsertib中的两个结合水由此形成两条不同的水桥：

         叔醇 → w1 → ATR催化环

         氧杂双环氧 → w2 → S2305

         两个水分别连接不同的药物官能团和蛋白结构，共同参与RP-3500在ATR活性位点中的局部氢键网络。[1]

5. A₂A腺苷受体有序水位点的配体结构调控

         Matricon等以A₂A腺苷受体（A₂A adenosine receptor，A₂AAR）与腺苷的复合物结构为基础，选择结合口袋中的一个有序水作为结构研究位点。该水位于一个较小的空腔中，与腺苷的腺嘌呤N3、核糖2′-羟基以及另一分子晶体水形成氢键。[2]

         研究者围绕同一个水位点比较了4种配体结构：腺苷（1）保留完整水介导相互作用；3-脱氮腺苷（2）将N3替换为碳，减少一条配体—水氢键；化合物3在相应位置引入甲基，用于考察水位点置换；化合物4则引入羟甲基，在置换有序水的同时，使羟基能够承担原水参与的部分氢键功能。[2]

图2 A₂A腺苷受体中的有序水及围绕该水位点的配体结构变化

         图a显示A₂A腺苷受体与腺苷复合物的局部结构。橙色棒状结构为腺苷，周围标注His264、Glu169、Asn253、Asn181、His250、Ser277、His278和Tyr9等受体残基；黑色虚线表示氢键。红色球表示其他晶体水，青色球表示该研究重点考察的有序水。[2]

         图b比较4种配体结构。化合物1为腺苷；化合物2为3-脱氮腺苷，其N3位置由氮变为碳，失去一条与目标有序水的氢键；化合物3在该位置引入甲基，属于水位点置换设计；化合物4引入羟甲基，属于置换有序水并利用羟基补充局部氢键作用的设计。原图中的 Interact、Displace和Replace 分别对应有序水相互作用、水位点置换和水位点替代三类结构处理方式。[2]

         图片来源： Matricon P. et al. Chemical Science, 2021, 12, 960–968, 原论文Fig. 1，期刊页码961。CC BY 3.0许可。[2]

5.1 N3去氮后的水位点保留与亲和力下降

         腺苷的腺嘌呤N3与目标有序水形成氢键。3-脱氮腺苷（化合物2）将该N3替换为碳，直接减少了一条配体—水氢键。[2]

         既往实验中，3-脱氮腺苷的A₂A受体亲和力约为39 μM；腺苷在不加入腺苷脱氨酶的实验条件下得到的估算Ki约为45 nM。由于两者的实验测定条件存在差异，原论文没有把这一数值差异作为精确的亲和力倍数比较。[2]

         分子动力学模拟显示，腺苷复合物中该有序水在100%的模拟快照中占据相应水位点；N3去氮以后，该水仍在约78%的3-脱氮腺苷模拟快照中停留于原位置。N3去氮减少了配体与有序水之间的氢键，但没有使该水位点完全消失。[2]

         后续能量分析显示，腺苷与3-脱氮腺苷之间的亲和力差异涉及受体—配体适配、配体内部能量和游离配体水合等多项贡献，结合态中与有序水的氢键变化并不是这一亲和力差异的主要能量来源。[2]

         因此，结构中少一条水介导氢键可以与亲和力下降同时出现，但不能据此把全部亲和力变化归因于这一条氢键。

5.2 3-甲基取代的水位点置换设计

         化合物3以3-脱氮腺苷为基础，在相应位置引入甲基。该甲基被设计为伸入目标有序水所在的空间，从而考察水位点置换对配体结合的影响。[2]

         实验中，化合物3在10 μM条件下未表现出显著的放射性配体置换，A₂A受体功能实验中的激活率也较低。[2]

         现有数据表明，3-甲基水位点置换设计没有恢复3-脱氮腺苷骨架的高亲和力。

5.3 3-羟甲基取代后的水置换与水网络重组

         化合物4同样由3-脱氮腺苷骨架衍生，在相应位置引入羟甲基。该结构被设计用于占据目标有序水的位置，同时利用羟基承担原水参与的局部氢键作用。[2]

         分子动力学模拟中，目标有序水在化合物4复合物中被完全置换，其他主要水合位点仍保持与腺苷复合物相近的分布。[2]

         实验结果显示，化合物4的A₂A受体结合Ki为103 nM，并表现为完全激动剂，功能实验EC₅₀为732 nM。相比3-脱氮腺苷和3-甲基化合物3，3-羟甲基取代恢复了较高的受体亲和力和功能活性。[2]

         进一步的自由能和水合网络计算显示，化合物4相对于3-脱氮腺苷的亲和力增益具有明显的焓驱动特征。有序水被置换后，周围水—水和蛋白—水相互作用发生重新组织，其中水网络重排对整体焓变化具有重要贡献。[2]

研究中的4个结构因此对应了三个不同层次的水位点变化：

6. 结合水对分子设计的意义

         蛋白结合位点中的水具有不同的局部环境。有些水参与较稳定的氢键网络，可以作为局部相互作用网络的一部分被保留；另一些水位点可以被药物取代基占据；还有一些水位点在被配体官能团置换后，可以转化为新的直接极性相互作用位点。[2-5]

在具体分子设计中，关键并不是简单判断“应该保留水还是排出水”，而是评估：

         保留、扰动或置换该水位点后，药物—蛋白—水整个体系将形成怎样的新相互作用网络。

         Camonsertib与ATR的复合物结构提供了结合水参与药物—蛋白识别的实例。其叔醇和氧杂双环氧分别通过w1和w2参与ATR局部氢键网络。[1]

         A₂A腺苷受体研究进一步显示，水位点可以通过药物结构修改主动调节：去除与有序水的一条氢键可伴随亲和力明显下降，但该下降不能全部归因于这一条氢键；单纯以甲基置换该水位点未能恢复较高亲和力，而在置换水的同时引入能够补充局部极性相互作用的羟甲基，则可恢复较高的受体亲和力和功能活性。[2]

         Wang等还基于RP-3500复合物结构提出，可以在两个结合水所占据的相应位置引入羟基或其他氢键供体/受体基团，以尝试直接与附近ATR残基形成新的氢键。[1]

         这一方案目前属于基于结构提出的后续分子设计假设，并没有实验结果证明置换w1或w2一定能够进一步提高Camonsertib的效力或选择性。新的官能团还可能影响药物的构象、脱溶剂化、空间匹配和局部水合网络，因此仍需要通过化合物合成和实验评价进行验证。[2-5]

         在涉及结合水的位点中，二维结构式中的羟基、醚氧或杂环氮等极性基团进入蛋白结合位点后，其作用不应只理解为一条孤立的氢键，而应结合药物官能团、结合水、蛋白残基及邻近水网络共同组成的三维识别体系进行分析。

         因此，一些看似较小的化学结构变化也可能造成明显的活性差异。一个原子或官能团的改变，可能同时影响药物的水合状态、结合水位置、氢键网络、局部构象以及与蛋白的接触方式。[2-5]

7. 结合水介导氢键与药物—蛋白识别研究相关化学品

表1. ATR抑制剂及PIKK家族选择性对照化合物

表2. 吗啉、嘧啶与吡唑类氢键药效团砌块

表3. 氧杂环丁烷与氧杂双环三维含氧砌块

         注：以上为阿拉丁代表性科研相关产品，具体用途应结合产品规格、批次COA及目标反应或评价体系确定。更多产品规格、级别和COA信息可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。

参考文献

[1] Wang G., Wang P., Zheng Z., et al. Molecular Architecture and Inhibition Mechanism of Human ATR-ATRIP. Science Bulletin, 2025, 70: 2137–2146. DOI: 10.1016/j.scib.2025.05.009.

[2] Matricon P., Suresh R. R., Gao Z.-G., Panel N., Jacobson K. A., Carlsson J. Ligand Design by Targeting a Binding Site Water. Chemical Science, 2021, 12: 960–968. DOI: 10.1039/D0SC04938G.

[3] Spyrakis F., Ahmed M. H., Bayden A. S., et al. The Roles of Water in the Protein Matrix: A Largely Untapped Resource for Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry, 2017, 60(16): 6781–6827. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.7b00057.

[4] Abel R., Young T., Farid R., Berne B. J., Friesner R. A. Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding. Journal of the American Chemical Society, 2008, 130(9): 2817–2831. DOI: 10.1021/ja0771033.

[5] Darby J. F., Hopkins A. P., Shimizu S., et al. Water Networks Can Determine the Affinity of Ligand Binding to Proteins. Journal of the American Chemical Society, 2019, 141(40): 15818–15826. DOI: 10.1021/jacs.9b06275.

[6] Arunan E., Desiraju G. R., Klein R. A., et al. Definition of the Hydrogen Bond: IUPAC Recommendations 2011. Pure and Applied Chemistry, 2011, 83(8): 1637–1641. DOI: 10.1351/PAC-REC-10-01-02.

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