植物样本核酸提取的难点，通常不在裂解本身，而在裂解后如何把核酸与多糖、多酚、色素、蛋白质、脂类及细胞壁残留有效分开。对叶片、种子、木质化组织、果实组织及次生代谢物丰富的药用植物样本而言，提取体系的选择会直接影响核酸得率、完整性、纯度以及后续PCR、qPCR、转录组建库和长读长测序的适配性。

        关键词：植物核酸提取；CTAB；SDS；TRIzol；柱纯化；多糖；多酚；RNA提取；DNA提取

1 植物样本核酸提取的技术背景

1.1 植物样本的主要干扰来源

（1）细胞壁造成的裂解门槛

        植物细胞外存在纤维素、半纤维素、果胶和木质素等结构成分，决定了其裂解难度通常高于动物细胞。若研磨不充分，裂解液即使化学强度较高，也难以完全释放核酸。

（2）多糖造成的共沉淀问题

        多糖是植物核酸提取中最常见的污染物之一。其问题不只是提高样品黏度，更在于容易与DNA或RNA共同沉淀，使提取物呈胶冻状、难溶解、移液困难，并进一步抑制PCR、逆转录和连接反应。

（3）多酚和色素造成的氧化污染

        茶叶、葡萄叶、果皮、木本叶片、药用植物根茎等样本中，多酚和色素含量常较高。组织破碎后，这类分子容易被氧化，并与核酸或蛋白形成复合物，导致样品褐变、纯度下降，严重时可直接导致扩增失败。

（4）内源核酸酶造成的降解风险

        植物组织中RNA酶和DNA酶活性差异明显。对于RNA提取，取样、速冻、研磨速度及裂解后失活效率直接决定完整性；对于DNA提取，若样本处理时间过长，也会出现断裂和片段化。

1.2 方法比较的核心评价维度

（1）裂解能力

        即体系能否有效破坏细胞壁、膜结构和核酸-蛋白复合物。

（2）去污染能力

        即体系对多糖、多酚、色素、蛋白质和脂类共提杂质的控制能力。

（3）核酸完整性

        即所获DNA或RNA是否保持较好的分子长度和较低降解程度。

（4）操作适配性

        包括步骤复杂度、时间成本、批量处理能力以及对实验经验的依赖程度。

（5）下游兼容性

        包括是否适合普通PCR、实时定量PCR、酶切连接、二代测序、三代长读长测序及转录组建库。

表1 植物核酸提取方法比较的主要维度

2 CTAB体系

2.1 CTAB体系的提取原理

（1）表面活性剂裂解作用

        CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子表面活性剂。其核心作用首先是破坏细胞膜和核膜，使胞内DNA、RNA、蛋白及多糖释放进入裂解液。与普通中性或阴离子表面活性剂不同，CTAB在高盐环境中不仅负责裂解，还参与后续杂质分离。

（2）高盐条件下的多糖分离逻辑

        CTAB法之所以在植物样本中长期占优势，关键并不只是CTAB本身，而是其与高浓度NaCl共同构成的分离环境。高盐条件有助于降低多糖与核酸共同沉淀的倾向，使DNA在后续沉淀时与部分多糖分开。对于富多糖样本，这一点往往决定方法是否成功。

（3）PVP与还原剂的辅助去污机制

        植物CTAB裂解液中常加入PVP或PVPP，以吸附多酚并减少其与核酸形成复合物。同时常加入β-巯基乙醇或DTT等还原剂，以抑制酚类氧化和褐变反应。对于多酚含量高的木本植物和药用植物，这类组分通常不是辅助成分，而是提取体系稳定运行的关键。

（4）有机抽提与醇沉步骤的作用

        CTAB裂解后通常需经氯仿或氯仿-异戊醇抽提，以去除蛋白、脂类和部分色素。随后再通过异丙醇或乙醇沉淀DNA。也就是说，CTAB法并不是单一试剂作用，而是“CTAB高盐裂解 + 去多酚辅助 + 有机抽提 + 醇沉纯化”的组合体系。

2.2 CTAB体系的应用优势

（1）对富多糖样本更有优势

        果实组织、种子、块根块茎、仙人掌样组织及胶质化材料中，多糖污染问题尤为突出。CTAB体系通常比SDS和普通柱法更能控制这类共沉淀。

（2）更适合植物基因组DNA提取

        CTAB体系尤其适合提取植物基因组DNA。若液氮研磨充分、抽提和洗涤步骤控制得当，通常可获得适合PCR、酶切和常规建库的DNA。

（3）可调性较强

        通过调节CTAB、NaCl、PVP和还原剂比例，可针对不同植物样本优化配方，因此对复杂样本的适配范围较广。

2.3 CTAB体系的局限

（1）步骤较多

        CTAB法通常包含温浴裂解、有机抽提、醇沉、洗涤和复溶等多个步骤，人工操作节点多，批间一致性容易受经验影响。

（2）有机溶剂负担较大

        传统CTAB法往往离不开氯仿抽提。若分层不清或界面吸取不稳，蛋白和色素残留较容易影响纯度。

（3）RNA提取并非通用首选

        虽然CTAB可发展出植物RNA提取方案，但在多数常规实验中，它并不是植物总RNA提取的首选通用方法，特别是在需要高完整度RNA时，优化成本较高。

3 SDS体系

3.1 SDS体系的提取原理

（1）阴离子表面活性剂裂解作用

        SDS即十二烷基硫酸钠，是典型的阴离子表面活性剂。其作用核心是破坏细胞膜和核膜，并使蛋白质变性，从而释放核酸并削弱核酸-蛋白复合状态。

（2）蛋白变性与复合体解离

        SDS带有强负电荷，可与蛋白结合并破坏其高级结构，使蛋白失去天然构象。对DNA提取而言，这一步有助于从染色质和核蛋白复合体中释放DNA；对RNA提取而言，SDS也能一定程度参与蛋白失活，但其RNA保护能力通常不如强变性胍盐体系。

（3）后续去污主要依赖盐析或有机抽提

        SDS本身更擅长裂解和蛋白变性，而不是针对多糖和多酚的专门控制。因此，SDS法通常需要与蛋白酶K、盐析、酚/氯仿抽提或后续柱纯化联用，才能得到纯度较好的核酸。

（4）体系构成相对直接

        与CTAB相比，SDS体系的裂解逻辑更简单，主要围绕“裂解 + 蛋白变性 + 后续纯化”展开。这也是其在常规DNA提取中长期存在的重要原因。

3.2 SDS体系的应用优势

（1）适合常规植物DNA提取

        对于多糖和多酚背景不算极端的叶片或培养组织样本，SDS体系可较方便地完成DNA提取，尤其适合常规PCR模板制备。

（2）方法灵活

        SDS法可与盐析法、酚/氯仿法及柱纯化联用，实验室可根据样本特点自由组合流程。

（3）成本相对较低

        SDS体系通常不依赖特殊表面活性剂或高成本专用试剂，对常规实验室而言可及性较高。

3.3 SDS体系的局限

（1）去多糖能力通常不如CTAB

        SDS擅长裂解和蛋白变性，但对高多糖植物样本的控制能力通常弱于CTAB。若样本本身富含储藏多糖或黏液质，SDS法更容易出现共沉淀和高黏度问题。

（2）去多酚能力依赖额外优化

        SDS本身不具备针对多酚污染的特异优势。若样本富含酚类成分，仍需加入PVP、还原剂或额外有机抽提步骤。

（3）对高质量长片段DNA未必最优

        在复杂植物样本中，若去杂不充分，SDS体系更容易得到“可扩增但纯度一般”的DNA。对于长读长测序所需高分子量DNA，通常还需进一步优化或改用CTAB体系。

4 TRIzol体系

4.1 TRIzol体系的提取原理

（1）酸性酚-胍盐强变性裂解

        TRIzol类体系通常由酸性酚和胍盐构成。胍盐可迅速破坏蛋白结构并强力失活RNA酶，酸性酚则参与核酸与蛋白的相分离控制。这使TRIzol在RNA保护方面具有显著优势。

（2）氯仿诱导的相分离机制

        加入氯仿离心后，体系通常分为上层水相、中间相和下层有机相。酸性条件下，RNA主要进入水相，DNA主要滞留在界面附近，蛋白则更多进入有机相。也就是说，TRIzol的关键不只是强裂解，而是通过相分离把RNA优先转移到较干净的水相中。

（3）RNA优先的分离路径

        TRIzol虽然也可进一步回收DNA和蛋白，但其方法学重心仍是RNA提取。它最适合回答“如何快速获得总RNA并尽快抑制RNA降解”这一问题。

（4）异丙醇沉淀与后续洗涤

        RNA进入水相后，通常再用异丙醇沉淀，再经乙醇洗涤以去除酚和盐残留。这一步若控制不当，容易导致RNA中残留酚、胍盐或色素。

4.2 TRIzol体系的应用优势

（1）对RNA保护能力强

        TRIzol体系在RNA酶失活方面表现突出，适合对RNA完整性要求较高的实验，如qRT-PCR、转录组建库和表达谱分析。

（2）适合快速建立强变性环境

        对于新鲜植物样本，TRIzol可在组织裂解后迅速建立强变性体系，减少RNA降解。

（3）适合常规总RNA提取

        对多数普通叶片、愈伤组织和培养材料，TRIzol通常能提供较高得率的总RNA，适合多数PCR级和常规建库级应用。

4.3 TRIzol体系在植物样本中的局限

（1）对富多糖、富多酚样本并不总是稳定

        TRIzol最擅长的是RNA保护和相分离，但在高多糖、高多酚植物样本中，水相常出现黏稠、混浊或带色情况，导致RNA纯度下降。

（2）相分离步骤依赖操作经验

        植物样本中的细碎残渣、色素和界面不清问题，较容易影响水相吸取。若界面控制不稳，RNA纯度和重复性会明显下降。

（3）并不适合作为高质量植物DNA主方法

        虽然TRIzol可回收DNA，但从植物基因组DNA质量、操作便利性和长片段保持看，TRIzol通常不是首选DNA主方法。

5 柱纯化体系

5.1 柱纯化体系的提取原理

（1）硅胶膜吸附机制

        柱纯化体系通常利用高浓度变性盐和醇，使核酸在特定条件下吸附于硅胶膜表面。随后通过洗涤去除蛋白、盐、小分子和部分色素，最后再以低盐缓冲液或水将核酸洗脱下来。

（2）“裂解”和“纯化”可分离

        柱体系既可以是完整提取方法，也可以只是后续纯化模块。很多植物样本并不是单靠柱子解决全部问题，而是先用裂解液或传统抽提法做前处理，再通过柱纯化提升最终纯度。

（3）标准化程度高

        柱纯化体系的最大特点，是吸附、洗涤和洗脱逻辑清晰，流程模块化，适合批量平行处理。

5.2 柱纯化体系的应用优势

（1）适合批量和标准化实验

        对于需要同时处理大量样本的实验，柱体系在时间控制和批间一致性方面通常优于传统有机抽提法。

（2）对PCR和常规测序更友好

        柱纯化得到的核酸通常盐和蛋白残留较低，更适合直接进入PCR、qPCR和一般建库流程。

（3）更适合常规RNA提取

        在植物RNA提取中，柱式试剂盒常通过专门裂解液和硅胶膜结合，实现较稳定的总RNA回收。对中等复杂度植物样本，其整体便利性通常优于手工TRIzol。

5.3 柱纯化体系的局限

（1）对极端复杂样本未必足够

        若植物样本富含多糖、多酚和色素，而前端裂解控制不足，单靠柱体系并不能完全解决问题。此时可能出现柱堵塞、吸附效率下降或纯度不稳定。

（2）高分子量DNA回收可能受限

        柱吸附-洗脱过程对超长DNA并不总是友好。对长读长测序所需高分子量DNA，柱体系通常不如优化后的CTAB体系。

（3）成本相对较高

        在大样本量、长期连续使用的实验中，柱式体系的耗材成本通常高于传统自配缓冲液方法。

表2 CTAB、SDS、TRIzol及柱纯化体系的核心比较

6 不同应用目标下的方法选择

6.1 植物基因组DNA提取

（1）常规PCR级DNA

        若样本为普通叶片或污染背景较轻，SDS体系和柱纯化体系通常都可满足需求。若实验目标仅限于PCR扩增和常规酶切，方法选择可优先考虑便捷性和通量。

（2）高纯度DNA

        若需要较高纯度且样本背景复杂，CTAB体系通常更稳妥，尤其在多糖和多酚问题明显时优势更突出。必要时可在CTAB后增加柱纯化或磁珠纯化，以进一步提升纯度。

（3）高分子量DNA

        对于长读长测序、光学图谱或高质量组装项目，高分子量DNA的完整性比单纯吸光比值更重要。此时通常更倾向于温和优化的CTAB体系，而不优先选择柱法。

6.2 植物总RNA提取

（1）常规表达分析

        对一般叶片和较新鲜样本，TRIzol体系和柱式RNA提取体系都可胜任。若实验目标为qRT-PCR，通常优先考虑纯度、降解控制和批量一致性。

（2）复杂样本RNA提取

        对于富多糖、富多酚样本，普通TRIzol法常不够稳定，此时更适合使用改良CTAB-RNA体系或专门针对植物样本优化的柱式RNA试剂盒。

（3）高完整度RNA建库

        若下游为转录组测序，RNA完整性和残留污染控制要求更高。此时单纯依赖高得率并不足够，更应优先选择对样本类型适配性最好的方法，而不是默认TRIzol。

6.3 极端植物样本

（1）富多酚木本叶片

        CTAB体系通常优先，且应提高PVP和还原剂配置。

（2）果肉和多糖丰富组织

        CTAB体系通常优于SDS和普通TRIzol，必要时需增加高盐和多次有机抽提步骤。

（3）色素丰富组织

        无论采用哪种体系，都需重视色素共提问题。TRIzol和SDS在这类样本中更容易出现颜色残留，CTAB或前裂解结合柱纯化往往更稳妥。

表3 不同目标下的推荐策略

7 结果评价与质量控制

7.1 前处理对提取结果的影响

（1）取样与速冻速度

        尤其在RNA实验中，取样后延迟处理会迅速增加降解风险。

（2）液氮研磨质量

        组织是否被充分、均匀地研磨，直接决定裂解效率和批间一致性。颗粒粗大常导致得率偏低和污染残留。

（3）样本量控制

        组织投料过多并不一定提高得率，反而容易造成裂解不完全、柱堵塞或相分离失败。

7.2 纯度指标的解释边界

（1）A260/280

        通常用于粗略判断蛋白污染，但并不能识别多糖和酚类污染的全部问题。

（2）A260/230

        对多糖、酚类、盐和有机残留更敏感。在植物样本中，这一指标往往比A260/280更能反映方法是否真正适配。

（3）电泳完整性

        对于DNA，需观察是否存在明显拖尾和片段化；对于RNA，需观察降解情况和条带完整性。仅凭分光比值无法替代完整性判断。

7.3 下游验证比纯度数字更重要

（1）PCR可扩增性

        对DNA样本，能否稳定扩增目标片段通常比单一吸光比值更能说明样本是否可用。

（2）反转录和qPCR表现

        对RNA样本，Ct值稳定性、扩增曲线和阴性对照情况比单纯高得率更重要。

（3）建库兼容性

        若样本最终用于二代或三代测序，则需把提取质量放在建库成功率和读长分布层面判断，而不是仅停留在常规分光结果。

8 植物样本核酸提取相关产品

表4 植物样本核酸提取与纯化相关产品表

        植物核酸提取中，CTAB、SDS、TRIzol和柱纯化体系并不存在单一的通用最优解。CTAB更适合复杂植物样本中的DNA提取，SDS更适合背景较轻样本的常规DNA制备，TRIzol更偏向RNA优先的快速提取，而柱纯化体系则在标准化和批量处理中更具优势。真正决定方法选择的，不是体系名称本身，而是样本中的多糖、多酚、色素和核酸酶负担，以及下游实验对纯度、完整性和分子长度的具体要求。

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[1] 核酸提取的黄金搭档：RNase A与蛋白酶K