1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立 Russell 改良 Movat 五色套染法的常规操作流程，适用于石蜡组织切片中弹力纤维、胶原纤维、网状纤维、蛋白聚糖、类纤维素、纤维蛋白及肌组织成分的综合色显示，尤其适合动脉粥样硬化斑块及复杂结缔组织结构的形态学观察。

1.2 原理简介

（1）Russell 改良 Movat 五色套染属于多步骤复合鉴别染色方法，通过不同染液依次作用，使组织内多种成分呈现稳定而有层次的综合色差异。

（2）Weigert 苏木素主要用于细胞核及弹力纤维染色，通常呈黑色。

（3）藏红品红用于显示类纤维素、纤维蛋白及部分肌组织成分，其中类纤维素、纤维蛋白多呈深红色，心肌和平滑肌多呈红色。

（4）阿利新蓝用于显示基质中的蛋白聚糖，使其呈蓝绿色。

（5）醇藏红花主要用于胶原纤维和网状纤维染色，使其呈黄色。

（6）泡沫细胞在该体系中多呈紫色，因此有利于在动脉粥样硬化相关切片中识别不同病变结构。

1.3 染色质量要求

（1）细胞核与弹力纤维呈黑色，轮廓清晰。

（2）胶原纤维和网状纤维呈黄色，分布明确。

（3）蛋白聚糖呈蓝绿色，类纤维素和纤维蛋白呈深红色，心肌和平滑肌呈红色，泡沫细胞呈紫色。

（4）切片整体颜色层次丰富、背景较干净、组织结构完整。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）常规石蜡组织切片。

（2）血管及动脉粥样硬化相关组织切片。

（3）需综合观察结缔组织、基质和肌组织成分的组织切片。

2.2 主要试剂

（1）海波溶液。

（2）阿利新蓝染色液。

（3）碱性乙醇溶液。

（4）Weigert A、Weigert B、Weigert C。

（5）藏红品红 A、藏红品红 B。

（6）磷钨酸溶液。

（7）弱酸分化液。

（8）醇藏红花染色液。

（9）Bouin 固定液。

（10）系列乙醇。

（11）蒸馏水。

（12）二甲苯或脱蜡透明液。

（13）中性树胶。

2.3 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）染色缸。

（3）镊子、吸水纸。

（4）石蜡切片机。

（5）微波炉。

（6）显微镜。

3 染液与样本准备

3.1 切片要求

（1）石蜡切片应常规制备，厚度一般建议为 5 μm 左右。

（2）切片应做好防脱片处理，以避免长时间和多步骤染色过程中脱片。

（3）进入染色前，切片应充分脱蜡并完成系列乙醇水化。

3.2 Weigert 苏木素染色液配制

（1）临用前按 Weigert A:Weigert B:Weigert C = 3:2:1 混合。

（2）混匀后即为 Weigert 苏木素染色液。

（3）该染液不可预先长时间配制，应现配现用。

3.3 藏红品红染色液配制

（1）临用前按藏红品红 A:藏红品红 B = 4:1 混合。

（2）混匀后即为藏红品红染色液。

（3）该染液不可预先长时间配制，应现配现用。

3.4 Bouin 固定液预热要求

（1）取适量 Bouin 固定液置于微波炉中中度加热 30～60 s。

（2）加热后应立即用于切片处理。

（3）处理时应注意温度控制，避免液体过热导致切片损伤。

4 实验流程

4.1 脱蜡与水化

（1）石蜡切片常规经二甲苯或脱蜡透明液脱蜡。

（2）经系列乙醇水化至水。

4.2 Bouin 固定液处理

（1）取经预热的 Bouin 固定液。

（2）将切片立即置入其中处理 10 min。

（3）处理后流水冲洗 10 min。

4.3 海波溶液处理

（1）将切片置于海波溶液中处理 5 min。

（2）处理后以蒸馏水冲洗 2～3 次。

4.4 阿利新蓝染色

（1）将切片置于阿利新蓝染色液中染色 20 min。

（2）染色后流水冲洗 2～5 min。

4.5 碱性乙醇处理

（1）用微波炉强火将碱性乙醇溶液预热至 45～60 ℃。

（2）将切片置于碱性乙醇溶液中处理 10 min。

（3）处理后流水冲洗 2～5 min。

4.6 Weigert 苏木素染色

（1）将切片置于预先配制好的 Weigert 苏木素染色液中。

（2）避光染色 60 min。

（3）染后先流水稍冲洗，再以蒸馏水冲洗 2～3 次，每次 3～5 min。

（4）该步骤后应确保多余染液充分洗去，以免影响后续染色。

4.7 藏红品红染色

（1）将切片置于预先配制好的藏红品红染色液中。

（2）避光染色 1 min。

（3）染后以蒸馏水冲洗 2～3 次，每次 3～5 min。

4.8 磷钨酸和弱酸分化处理

（1）将切片置于磷钨酸溶液中处理 5 min。

（2）不经中间冲洗，直接转入弱酸分化液中处理 5 min。

（3）处理后以蒸馏水冲洗 2～3 次，每次 3～5 min。

4.9 藏红花染色前脱水

（1）切片先置于 95% 乙醇中处理 1 min。

（2）再置于 100% 乙醇中处理 2 次，每次 1 min。

4.10 醇藏红花染色

（1）将切片置于醇藏红花染色液中染色 5 min。

4.11 脱水、透明与封片

（1）切片经无水乙醇脱水 2 次，每次 1 min。

（2）转入二甲苯或脱蜡透明液中透明。

（3）覆盖盖玻片并封片。

（4）封片后应避免气泡，并保持封固均匀。

5 染色结果

5.1 黑色

（1）细胞核。

（2）弹力纤维。

5.2 黄色

（1）胶原纤维。

（2）网状纤维。

5.3 蓝绿色

（1）蛋白聚糖。

5.4 深红色

（1）类纤维素。

（2）纤维蛋白。

5.5 红色

（1）心肌。

（2）平滑肌。

5.6 紫色

（1）泡沫细胞。

6 结果判读要点

6.1 弹力纤维与细胞核判读

（1）弹力纤维和细胞核呈黑色时，通常边界较清楚，有利于观察血管壁结构和组织层次。

（2）若黑色背景过重，应优先检查 Weigert 苏木素染色后的冲洗是否充分。

6.2 胶原纤维和网状纤维判读

（1）胶原纤维和网状纤维呈黄色时，有利于观察纤维性间质及斑块纤维帽等结构。

（2）若黄色不明显，应综合考虑磷钨酸处理、弱酸分化和醇藏红花染色步骤。

6.3 蛋白聚糖判读

（1）蛋白聚糖呈蓝绿色时，有助于识别富含基质的区域。

（2）阿利新蓝染色不足或后续处理过强均可能导致该颜色减弱。

6.4 类纤维素、纤维蛋白及肌组织判读

（1）类纤维素、纤维蛋白呈深红色，心肌和平滑肌呈红色，有利于与黄色胶原和蓝绿色基质区分。

（2）若红色成分普遍偏弱，应优先检查藏红品红染色和后续分化步骤。

6.5 泡沫细胞判读

（1）泡沫细胞呈紫色时，在动脉粥样硬化相关切片中具有较好的辅助识别意义。

（2）判读时应结合其位置和周围病变背景综合分析。

7 常见问题与原因分析

7.1 染色后未显示全部五种颜色

（1）染液染色力存在差异。

（2）切片成分本身分布有限。

（3）多步骤染色终点控制不一致，导致部分颜色不充分。

7.2 切片脱片12

（1）未做防脱片处理。

（2）切片附着不牢。

（3）多次冲洗和长时间染色造成机械性脱片。

7.3 弹力纤维显示不理想

（1）弹力纤维分化时间控制不当。

（2）通常弹力纤维相关分化在 2～3 min 内完成，若处理过度可能导致显示减弱。

7.4 后续染色受抑制

（1）Weigert 苏木素染色后流水冲洗不足。

（2）残留染液会抑制后续步骤，导致综合色层次不清。

7.5 背景偏深或综合色失衡

（1）染色步骤复杂，操作者节奏不一致。

（2）不同染液处理时间不稳定。

（3）组织切片厚薄不均或脱蜡不彻底。

8 应用范围

8.1 动脉粥样硬化相关研究

（1）用于显示动脉粥样硬化斑块中的多种组织成分。

（2）适合观察纤维帽、蛋白聚糖、泡沫细胞及弹力纤维分布。

8.2 结缔组织综合观察

（1）用于同时显示胶原纤维、网状纤维和弹力纤维。

（2）适合复杂结缔组织背景下的多成分对比观察。

8.3 肌组织与基质关系观察

（1）用于显示心肌和平滑肌与周围间质、基质成分的关系。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理 Bouin 固定液、乙醇、二甲苯及各类染色液时应在通风条件良好的环境下操作。

9.2 废液处理

（1）含固定液、乙醇、二甲苯及染色残液的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品处理规范处置。

10 Russell改良Movat五色套染法相关试剂选型

更多相关文章，详见下方：

[1] 结缔组织观察实验

[2] 疏松结缔组织形态学观察实验