1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立Puchtler鞣酸-偶氮荧光桃红法肌纤维染色的常规操作流程，适用于石蜡组织切片中肌纤维与胶原纤维的鉴别观察，可用于平滑肌、骨骼肌、心肌相关组织的形态学研究，也可用于乳腺、皮肤等含肌上皮细胞成分组织的辅助显示。

1.2 原理简介

（1）鞣酸-偶氮荧光桃红法属于鉴别染色方法，其核心在于两种酸性染料顺序作用后对不同组织成分产生差异性着色。

（2）苏木素染色液首先用于细胞核染色，使细胞核呈蓝色，便于后续组织结构辨认。

（3）鞣酸较易进入渗透性较强的胶原纤维体系，经后续处理后胶原纤维呈黄色。

（4）偶氮荧光桃红较易进入渗透性相对较低的肌纤维体系，使肌纤维和肌上皮细胞呈玫瑰红色，从而实现与胶原纤维的清晰区分。

1.3 染色质量要求

（1）肌纤维和肌上皮细胞着色鲜明，呈稳定玫瑰红色。

（2）胶原纤维分色清楚，呈黄色。

（3）细胞核蓝染清晰，背景干净，组织轮廓完整。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）肌组织相关石蜡切片。

（2）乳腺组织石蜡切片。

（3）皮肤组织石蜡切片。

（4）其他需区分肌纤维与胶原纤维的常规组织切片。

2.2 主要试剂

（1）苏木素染色液。

（2）鞣酸分化液。

（3）磷钼酸分化液。

（4）偶氮荧光桃红染色液。

（5）酸性醇分化液。

（6）Bouin固定液、Carnoy固定液或中性福尔马林。

（7）95%乙醇。

（8）无水乙醇。

（9）蒸馏水。

（10）二甲苯或脱蜡透明液。

（11）中性树胶。

2.3 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）染色缸。

（3）镊子、吸水纸。

（4）石蜡切片机。

（5）烤片设备。

（6）显微镜。

3 染液与样本准备

3.1 固定要求

（1）常规组织宜固定于Bouin固定液2～3 h，通常有利于获得较好的染色对比。

（2）Carnoy固定液或中性福尔马林亦可使用，但部分固定体系可能导致染色偏淡。

（3）同批样本宜尽量采用一致的固定体系和固定时间，以减少染色差异。

3.2 脱水、包埋与切片要求

（1）固定后样本可直接转入95%乙醇中，按常规流程脱水、包埋。

（2）石蜡切片厚度建议为4 μm。

（3）切片厚薄应尽量一致，以提高同批样本染色均一性和结果可比性。

3.3 脱蜡要求

（1）石蜡切片应常规二甲苯或脱蜡透明液脱蜡至水。

（2）脱蜡不充分易导致染色不均或背景发灰。

（3）进入染色步骤前，切片应处于充分水化状态。

4 实验流程

4.1 固定与包埋

（1）常规组织固定于Bouin固定液2～3 h。

（2）固定后直接转入95%乙醇中。

（3）按常规流程完成脱水、包埋。

4.2 切片与脱蜡

（1）石蜡切片厚4 μm。

（2）常规二甲苯或脱蜡透明液脱蜡至水。

4.3 核染色

（1）将切片置于苏木素染色液中浸染8～10 min。

（2）取出后流水冲洗10 min。

（3）核染应以细胞核清晰蓝染为宜，不宜过浅。

4.4 鞣酸分化

（1）将切片置于鞣酸分化液中处理10 min。

（2）处理后流水冲洗1 min。

（3）该步骤有助于后续胶原纤维与肌纤维的差异显色。

4.5 磷钼酸分化

（1）将切片置于磷钼酸分化液中处理10 min。

（2）处理结束后可直接进入偶氮荧光桃红染色步骤。

（3）该步骤应保持时间稳定，以减少批间分色波动。

4.6 偶氮荧光桃红染色

（1）将切片置于偶氮荧光桃红染色液中浸染10～15 min。

（2）染色时间可根据组织类型和染色强度适当微调。

（3）以肌纤维着色充分而不过度为宜。

4.7 酸性醇分化

（1）将切片置于酸性醇分化液中分化3～5 s。

（2）分化程度应控制至切片上多余红色染液基本脱去、肌纤维呈鲜红或玫瑰红色为止。

（3）该步骤为本方法关键控制点之一，不宜分化不足或过度分化。

4.8 脱水、透明与封片

（1）染色完成后用无水乙醇反复脱水多次，并按梯度完成脱水。

（2）转入二甲苯或脱蜡透明液中透明。

（3）滴加中性树胶，覆盖盖玻片，完成封片。

（4）封片后应避免产生气泡，并保持胶液分布均匀。

5 染色结果

5.1 肌纤维与肌上皮细胞

（1）肌纤维呈玫瑰红色。

（2）肌上皮细胞呈玫瑰红色。

5.2 胶原纤维

（1）胶原纤维呈黄色。

（2）胶原纤维与肌纤维之间应具有清晰颜色对比。

5.3 细胞核

（1）细胞核呈蓝色。

（2）核染应能较好显示组织轮廓和细胞定位关系。

6 结果判读要点

6.1 肌纤维判读

（1）肌纤维着色鲜明且连续时，提示肌组织结构保存较好。

（2）肌纤维若着色偏淡，应优先回查固定体系、偶氮荧光桃红染色时间及酸性醇分化程度。

6.2 胶原纤维判读

（1）胶原纤维黄色分布清楚时，有利于观察间质成分与肌组织边界。

（2）若胶原纤维与肌纤维分界不清，应优先检查鞣酸分化和磷钼酸分化步骤。

6.3 肌上皮细胞判读

（1）肌上皮细胞呈玫瑰红色时，有助于在乳腺、皮肤等组织中进行辅助识别。

（2）判读时应结合细胞核位置与组织结构背景综合分析。

7 常见问题与原因分析

7.1 肌纤维着色偏淡

（1）固定体系不理想，尤其未采用Bouin固定液时更易出现。

（2）偶氮荧光桃红染色时间不足。

（3）酸性醇分化过度。

7.2 切片整体偏红

（1）酸性醇分化不足。

（2）偶氮荧光桃红染色过深。

（3）脱水前未有效去除多余染液。

7.3 肌纤维与胶原纤维分色不清

（1）鞣酸分化不充分。

（2）磷钼酸分化时间不足或不稳定。

（3）组织固定和切片厚度不一致造成批间差异。

7.4 核染不清

（1）苏木素染色时间不足。

（2）流水冲洗不充分或过度。

（3）脱蜡不彻底影响核染均一性。

8 应用范围

8.1 肌组织观察

（1）平滑肌相关组织观察。

（2）骨骼肌与心肌相关组织观察。

8.2 结缔组织鉴别

（1）用于区分肌纤维与胶原纤维。

（2）适合观察肌层连续性及间质胶原分布。

8.3 肌上皮相关研究

（1）可显示肌上皮细胞。

（2）适用于乳腺和皮肤等含肌上皮细胞成分组织的形态学研究。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理固定液、酸性醇、二甲苯及染色液时应在通风条件良好的环境下操作。

9.2 废液处理

（1）含固定液、乙醇、二甲苯和染色残液的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品处理规范处置。

10 肌纤维染色（Puchtler 鞣酸偶氮荧光桃红法）相关试剂选型

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[1] 肌纤维内肌电信号的解析实验

[2] 从骨骼肌分离和培养单肌纤维