1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立子宫颈细胞学p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测的常规操作流程，适用于液基细胞学样本中细胞周期失调细胞的检测，可作为子宫颈细胞学检查和高危型人乳头瘤病毒检测的补充方法，用于子宫颈上皮高级别病变风险评估和辅助判读。本规程仅用于科研实验、方法建立及实验室技术参考，不作为临床诊断、治疗或医疗决策的直接依据。

1.2 生物标志物意义

（1）p16为细胞周期调控相关抑癌蛋白。高危型人乳头瘤病毒持续感染时，E7蛋白可介导pRb功能失活，异常增殖细胞中可出现p16过度表达，因此p16强阳性可提示子宫颈上皮细胞存在异常增殖相关改变，但双染判读仍应以同一细胞内p16与Ki-67共同阳性为核心依据。

（2）Ki-67为细胞增殖相关核抗原，可反映细胞进入增殖周期的活跃程度，是评价细胞增殖活性的常用指标。

（3）正常生理条件下，p16与Ki-67在同一细胞中通常不同时表达。若同一细胞内同时出现p16和Ki-67阳性，提示细胞周期调控失常和异常增殖，可作为提示子宫颈高级别病变风险的客观标志。

1.3 方法原理

（1）本方法基于液基薄层细胞制片和免疫细胞化学双染技术，在同一细胞内分别显示p16与Ki-67的表达状态。

（2）本规程采用p16棕色显色、Ki-67红色显色的判读体系。双染阳性判读不依赖单纯细胞形态学异常，而以同一细胞内p16与Ki-67的共同表达为核心依据。

（3）双染检测应采用经验证可兼容的p16一抗、Ki-67一抗及配套检测系统，保证两种信号能够在同一玻片中稳定显示并可清晰区分。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）子宫颈液基细胞学样本。

（2）采用膜式或沉降式液基薄层细胞制片的未染色玻片。

2.2 主要试剂

（1）p16一抗。

（2）Ki-67一抗。

（3）Tris-EDTA抗原修复液。

（4）TBS或TBS-T洗涤缓冲液。

（5）3% 过氧化氢封闭液。

（6）蛋白封闭液，如山羊血清或BSA封闭液。

（7）p16检测系统及DAB显色液。

（8）Ki-67检测系统及Fast Red显色液。

（9）苏木素复染液。

（10）Scott蓝化液或同类返蓝液。

（11）水性封片剂。

2.3 质控相关材料

（1）阳性质控：已知p16/Ki-67双染阳性的宫颈液基细胞学样本制片或细胞块切片。

（2）内部阴性质控：同一玻片中已知p16和Ki-67阴性的成熟鳞状上皮细胞或其他阴性背景细胞。

（3）外部阴性对照：与待测样本同批处理，但以抗体稀释液替代一抗，或分别去除p16一抗、Ki-67一抗的平行玻片。

2.4 耗材与器材

（1）液基细胞学制片耗材。

（2）防脱载玻片与盖玻片。

（3）湿盒。

（4）恒温修复装置、水浴锅或压力修复装置。

（5）显微镜。

3 标本制备与前处理

3.1 标本要求

（1）优先选用液基细胞学剩余样本制备专用未染色玻片。

（2）标本应保证细胞形态相对完整，并获得较好固定，以利于抗原保存和后续判读。

（3）开展检测前应先进行标本满意度评估。

3.2 制片

（1）采用膜式或沉降式液基薄层细胞制片技术。

（2）制片应保证细胞分布适中，避免细胞严重重叠、聚集或脱落。

（3）建议使用防脱载玻片，以减少后续抗原修复和洗涤过程中的细胞脱片。

3.3 固定

（1）制片后按液基平台固定要求处理。

（2）固定完成后玻片应充分干燥并妥善保存，避免反复受潮。

4 实验流程

4.1 制片后前处理

（1）确认玻片细胞附着情况良好，细胞分布可满足判读要求。

（2）如玻片保存时间较长，染色前应先恢复至室温。

4.2 抗原修复

（1）将玻片置于Tris-EDTA抗原修复液中。

（2）常规可采用pH 9.0 条件进行热修复。

（3）修复后室温自然冷却。

（4）以TBS或TBS-T清洗 3 次，每次 3 min。

（5）抗原修复过程中应重点避免细胞脱片。

4.3 内源性过氧化物酶封闭

（1）滴加 3% 过氧化氢封闭液，室温作用 10 min。

（2）以TBS或TBS-T清洗 3 次，每次 3 min。

4.4 蛋白封闭

（1）滴加山羊血清或BSA封闭液，覆盖全部细胞区域。

（2）室温孵育 10 min。

（3）倾去封闭液，不必强力冲洗。

4.5 p16一抗孵育

（1）滴加p16一抗，覆盖全部细胞区域。

（2）室温孵育 30～60 min，具体时间按抗体验证结果确定。

（3）以TBS或TBS-T清洗 3 次，每次 3 min。

4.6 p16检测与DAB显色

（1）滴加与p16一抗匹配的检测系统，室温孵育 20～30 min。

（2）以TBS或TBS-T清洗 3 次，每次 3 min。

（3）滴加DAB显色液，显色 3～5 min。

（4）蒸馏水终止反应。

4.7 Ki-67一抗孵育

（1）滴加Ki-67一抗，覆盖全部细胞区域。

（2）室温孵育 30～60 min，具体时间按抗体验证结果确定。

（3）以TBS或TBS-T清洗 3 次，每次 3 min。

4.8 Ki-67检测与Fast Red显色

（1）滴加与Ki-67一抗匹配的检测系统，室温孵育 20～30 min。

（2）以TBS或TBS-T清洗 3 次，每次 3 min。

（3）滴加Fast Red显色液，显色 8～12 min。

（4）蒸馏水轻洗终止反应。

4.9 复染、返蓝与封片

（1）以苏木素复染 20～30 s。

（2）自来水冲洗后，用Scott蓝化液返蓝 10～20 s。

（3）蒸馏水轻洗。

（4）采用水性封片剂封片。

（5）使用Fast Red显色体系时，不宜进行乙醇脱水和二甲苯透明，以免红色信号减弱或消失。

5 质量控制

5.1 总体要求

（1）每批检测应同时设置阳性质控和阴性质控。

（2）检测平台、试剂、耗材和设备应完成适配性验证后再投入常规使用。

（3）操作人员和判读人员应经过培训和考核。

5.2 阳性质控

（1）建议使用已知双染阳性的病例作为阳性质控。

（2）阳性质控应能显示清晰、可识别的双染阳性细胞。

5.3 阴性质控

（1）内部阴性质控用于确认背景细胞无异常双染信号。

（2）外部阴性对照用于判断是否存在非特异性着色或检测系统污染。

5.4 抗原修复质控

（1）若抗原修复后细胞明显脱片，应重新评估修复条件和玻片附着性能。

（2）对于细胞附着较差样本，应优先降低修复强度而非延长修复时间。

6 标本满意度评估

6.1 基本原则

（1）标本满意度按子宫颈细胞学常规满意度评估原则进行判断。

（2）满意度评估应在正式双染结果判读前完成。

6.2 判读条件

（1）若标本评估为不满意，且未见双染阳性细胞，则应报告为标本不满足判读条件。

（2）无论标本满意或不满意，只要存在至少 1 个双染阳性细胞，即可判读为双染阳性。

7 染色结果判读标准

7.1 双染阳性判断标准

（1）同一细胞内同时存在p16和Ki-67阳性信号。

（2）本规程推荐的显色体系中，p16为细胞质和/或细胞核棕色，Ki-67为细胞核红色。

（3）二者必须定位于同一个细胞内，且位于同一聚焦平面。

（4）双染阳性判读不依赖单纯细胞形态学异常。

7.2 双染阴性判断标准

（1）仅见蓝色宫颈上皮细胞。

（2）仅见p16阳性的宫颈上皮细胞。

（3）仅见Ki-67阳性的宫颈上皮细胞。

（4）p16与Ki-67虽同时出现在同一细胞簇区域，但不位于同一细胞、不同一聚焦平面者，应判读为阴性。

7.3 深染色细胞处理

（1）当p16染色较深而影响Ki-67核信号判断时，可适当增强显微镜光照强度。

（2）应在确认核内是否真实存在红色信号后再作最终判读。

8 双染判读流程

8.1 低倍筛查

（1）先以 10× 或 20× 视野浏览整张玻片。

（2）优先寻找单个、散在分布的可疑双染细胞。

8.2 散在细胞判读

（1）如发现单个、散在且符合双染标准的细胞，可直接判读为阳性。

（2）如未发现此类细胞，则继续评估细胞簇区域。

8.3 细胞簇判读

（1）先在细胞簇边缘寻找单个、散在的双染阳性细胞。

① 若存在，判读为阳性。

② 若不存在，继续下一步。

（2）评估细胞簇中p16染色方式。

① 若p16为局灶性染色，判读为阴性。

② 若p16为弥漫性染色，继续下一步。

（3）评估Ki-67阳性细胞核与p16阳性细胞质是否位于同一聚焦平面。

① 若不在同一聚焦平面，判读为阴性。

② 若Ki-67阳性细胞核嵌于p16阳性细胞质内，且位于同一聚焦平面，判读为阳性。

9 常见问题与原因分析

9.1 细胞脱片明显

（1）抗原修复条件过强。

（2）载玻片附着性能不足。

（3）前处理和制片质量不稳定。

9.2 背景染色过重

（1）显色系统引起非特异性背景着色。

（2）洗涤不充分或显色时间控制不当。

（3）一抗浓度过高或封闭不足。

9.3 双染判读困难

（1）显色过深，导致第二种颜色被遮盖。

（2）细胞重叠严重，聚焦平面判断困难。

（3）细胞簇中p16弥漫染色但Ki-67核定位不清。

9.4 样本不满足判读条件

（1）细胞量不足。

（2）背景非特异性染色过重。

（3）若玻片超过 75% 区域存在明显非特异性背景着色，应报告为标本不满足判读条件。

10 报告建议

10.1 阳性报告

（1）报告为p16/Ki-67双染阳性。

（2）提示存在细胞周期失调细胞，支持子宫颈高级别病变风险升高的可能。

10.2 阴性报告

（1）报告为p16/Ki-67双染阴性。

（2）提示本次检测中未见符合判读标准的双染阳性细胞。

10.3 不满足判读条件报告

（1）报告为样本不满足判读条件。

（2）必要时建议结合临床情况和其他检测结果决定是否重新取样。

11 安全与操作规范

11.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理DAB、Fast Red、过氧化氢及其他化学试剂时应在规范条件下操作。

11.2 质量与培训要求

（1）检测技术平台上线前应完成验证。

（2）操作人员和判读人员应经过培训、考核并持续质控。

11.3 废弃物处理

（1）含DAB、显色底物、洗液及污染耗材应分类收集。

（2）所有废弃物应按实验室生物及化学废弃物处理规范处置。

12 相关试剂与材料选型

表1 子宫颈细胞学p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测相关试剂选型

更多相关文章，详见下方：

[1] 橘黄G6、EA36与EA50在巴氏染色体系中的功能区分