蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera，PROTAC）是一类利用细胞泛素—蛋白酶体系统（ubiquitin–proteasome system，UPS）选择性降低目标蛋白水平的异双功能分子。它是一种靶向蛋白降解（targeted protein degradation，TPD）技术。

         传统小分子抑制剂通常需要持续占据蛋白的活性位点或配体结合位点，以阻断蛋白功能；PROTAC则通过招募E3泛素连接酶，使目标蛋白被泛素化并由蛋白酶体降解。其核心作用由“抑制蛋白功能”转变为“降低蛋白数量”。

1. PROTAC解决什么问题

1.1 传统小分子抑制剂的作用特点

         多数传统小分子药物通过与靶蛋白形成二元复合物发挥作用。例如，激酶抑制剂可占据三磷酸腺苷结合位点，受体拮抗剂可阻止天然配体与受体结合。

这种作用方式通常具有以下特征：

         ①药效依赖药物与靶蛋白保持一定的结合占有率；

         ②主要影响与结合位点直接相关的蛋白功能；

         ③药物解离后，仍然存在的靶蛋白可能恢复功能。

         对于具有明确催化口袋的激酶、受体和代谢酶，传统抑制策略已经取得显著成效。但一些疾病相关蛋白缺乏适合小分子调节的功能口袋，或者同时具有催化活性、支架组装和蛋白相互作用等多种功能。此时，阻断单一活性位点未必能够消除该蛋白的全部生物学作用。

1.2 PROTAC的基本原理

PROTAC的一端结合目标蛋白，另一端结合E3泛素连接酶复合物中的底物识别组分，中间由连接子连接。其基本过程为：

         目标蛋白结合 → E3泛素连接酶招募 → 目标蛋白–PROTAC–E3三元复合物形成 →目标蛋白泛素化 → 蛋白酶体识别并降解目标蛋白

         2001年，Sakamoto等设计了含肽型Protac-1。该分子由识别MetAP-2的ovalicin衍生基团与招募SCF^β-TRCP的IκBα磷酸肽连接而成，并在体外泛素化体系和Xenopus卵提取物中证明其能够诱导MetAP-2泛素化和降解。

         这项研究确立了PROTAC的基本思想：药物不仅可以直接抑制蛋白功能，也可以重新指定E3连接酶的底物，使目标蛋白进入细胞的降解过程。

2. PROTAC的分子组成

         一个典型PROTAC由目标蛋白配体、连接子和E3连接酶配体组成。

2.1 目标蛋白配体

         目标蛋白配体常被称为warhead，负责识别目标蛋白。它可以来源于已知抑制剂、受体配体或其他能够与目标蛋白结合的小分子。

         传统抑制剂中的配体通常需要占据关键功能位点，并直接产生功能抑制；PROTAC中的目标蛋白配体主要负责将目标蛋白引入降解过程，因此不一定需要具有很强的直接抑制活性。

目标蛋白配体的选择需要同时考虑：

         ①与目标蛋白的结合能力和选择性；

         ②配体与蛋白结合后的溶剂暴露区域；

         ③可供连接子修饰的化学位点；

         ④连接子引入后是否破坏原有结合构象。

         因此，将一个已知抑制剂改造成PROTAC时，不能任意选择连接位置。连接子需要从不影响关键结合相互作用、且能够朝向蛋白表面外侧的位置延伸。

2.2 E3连接酶配体

         E3泛素连接酶负责选择泛素化底物。PROTAC通常通过小分子配体结合E3复合物中的底物识别组分。

目前使用较广泛的两类招募体系是：

         ①Cereblon蛋白（CRBN），属于CRL4^CRBN连接酶复合物；

         ②von Hippel–Lindau蛋白（VHL），属于CRL2^VHL连接酶复合物。

         其中，CRL表示Cullin-RING泛素连接酶（Cullin-RING ligase）。CRBN配体多由沙利度胺、来那度胺或泊马度胺相关结构衍生；VHL配体通常含有能够识别VHL底物结合区域的羟脯氨酸衍生结构。

         E3连接酶的选择会影响降解效率、细胞或组织层面的药效选择性以及亚细胞定位适配性；PROTAC本身的组织分布还取决于其理化性质和药代动力学特征。不同E3复合物具有不同的蛋白表面、表达水平和亚细胞定位，因此同一个目标蛋白使用CRBN和VHL招募体系时，可能产生明显不同的降解结果。

2.3 连接子

         连接子不是被动连接两个配体的化学链段。它决定目标蛋白与E3连接酶接近时的距离、方向和构象自由度，同时影响整个PROTAC分子的溶解性、稳定性和细胞通透性。

连接子设计主要涉及：

         ①链长；

         ②柔性与刚性；

         ③聚乙二醇、烷基链或环状结构的组成；

         ④两端的连接方向；

         ⑤氢键供体和受体数量；

         ⑥分子内折叠倾向。

         连接子过短，目标蛋白与E3连接酶之间可能产生空间冲突；连接子过长或过于柔软，则会增加不能支持泛素转移的构象数量。PROTAC设计不是将两个高亲和力配体简单连接，而是需要使目标蛋白和E3连接酶形成适合泛素化的空间排列。

3. PROTAC介导蛋白降解的分子机制

         PROTAC本身不直接水解目标蛋白，而是通过同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶复合物，诱导形成生产性三元复合物，使目标蛋白获得泛素化标记，随后由26S蛋白酶体识别并降解。整个过程包括三元复合物形成、目标蛋白泛素化、蛋白酶体降解以及PROTAC可能发生的后续周转。

3.1 泛素化反应

         泛素化主要由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶连续完成。首先，E1利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）激活泛素；随后，泛素转移至E2；最后，E3促进携带泛素的E2与底物蛋白正确接近，使泛素转移至底物蛋白。

         对于CRBN和VHL所属的RING型E3复合物，泛素通常直接由E2转移至目标蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基。

简化反应如下：

1. 泛素激活

Ub–COOH + ATP + E1 →

E1–S–CO–Ub + AMP + PPi

2. 泛素转移至E2

E1–S–CO–Ub + E2–SH →

E1–SH + E2–S–CO–Ub

3. 泛素转移至目标蛋白

E2–S–CO–Ub + POI–Lys–NH₂ →

E2–SH + POI–Lys–NH–CO–Ub

         其中，Ub表示泛素，POI表示目标蛋白（protein of interest）。“E1–S–CO–Ub”和“E2–S–CO–Ub”为硫酯键中间体；泛素羧基末端与目标蛋白赖氨酸侧链形成异肽键。经过多轮反应后，目标蛋白形成适合蛋白酶体识别的泛素链，随后被26S蛋白酶体展开并降解为短肽。

3.2 PROTAC降解循环

PROTAC利用上述天然泛素化机制，改变E3连接酶对底物的识别。完整过程包括：

         PROTAC进入细胞 → 分别结合目标蛋白和E3底物识别组分 → 形成目标蛋白–PROTAC–E3三元复合物 → E2携带的泛素转移至目标蛋白 → 目标蛋白形成蛋白酶体可识别的泛素化信号 → 26S蛋白酶体降解目标蛋白 → PROTAC从复合物中解离，并可能参与下一轮降解

         目标蛋白被泛素化后，PROTAC可能从复合物中释放并继续参与新的降解过程。因此，部分PROTAC能够表现出可周转的“事件驱动”药理特征：分子不必长期占据每一个目标蛋白，只需触发有效的泛素化和降解事件。

         这种周转并非无限进行。其效率仍受到细胞内游离浓度、分子稳定性、复合物解离速率、目标蛋白再合成速度和蛋白酶体活性等因素限制。

3.3 生产性三元复合物

         目标蛋白、PROTAC和E3连接酶能够形成三元复合物，并不代表目标蛋白一定会被降解。只有能够促进有效泛素转移的三元复合物，才属于生产性三元复合物。

生产性三元复合物需要满足以下条件：

         ①目标蛋白与E3连接酶之间不存在严重空间冲突；

         ②目标蛋白表面通常具有构象上可接近、能够被有效泛素化的赖氨酸等受体位点；

         ③这些位点与E2携带的泛素具有有利于泛素转移的空间关系；

         ④三元复合物的形成和解离动力学与有效泛素转移相匹配；

         ⑤泛素化后的目标蛋白能够进入蛋白酶体降解过程。

         2017年解析的BRD4^BD2–MZ1–VHL晶体结构表明，PROTAC不仅使两个蛋白接近，还能诱导目标蛋白与E3连接酶之间形成新的蛋白—蛋白接触。这些新生相互作用会影响三元复合物的稳定性、协同性和降解选择性。

4. 决定PROTAC降解效果的关键因素

4.1 三元复合物的构象与动力学

         PROTAC的两个配体分别具有较高亲和力，并不保证最终能够高效降解目标蛋白。如果三元复合物中的蛋白排列方向不合适，目标蛋白赖氨酸可能无法接近E2；如果复合物解离过快，也可能来不及完成充分的泛素化。相反，二元亲和力并非最高的分子，如果能够形成更适合泛素转移的三元复合物，仍可能表现出更强的降解作用。

三元复合物还可能表现出不同程度的协同性：

         ①正协同性：一个蛋白的结合有利于另一个蛋白进一步结合；

         ②负协同性：两个蛋白同时结合时产生不利相互作用；

         ③无明显协同性：三元复合物主要由两个二元结合事件维持。

         正协同性可能提高三元复合物的稳定性和选择性，但不是高效降解的必要条件。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）降解剂研究表明，减少三元复合物中的空间冲突，即使没有明显正协同性，也能够产生有效降解。

4.2 目标蛋白的结构特征

目标蛋白能否被有效降解，与其表面结构密切相关，主要包括：

         ①可接近赖氨酸的数量和位置；

         ②蛋白表面的柔性；

         ③目标蛋白是否处于稳定蛋白复合物中；

         ④泛素化后能否被蛋白酶体有效展开；

         ⑤目标蛋白与E3连接酶是否位于相同细胞区室。

         同一个PROTAC对结构相近的蛋白家族成员可能产生不同的降解效果。这种选择性并不一定来自目标蛋白配体的结合选择性，也可能来自不同蛋白形成三元复合物时的空间排列差异。

4.3 细胞内有效浓度

         PROTAC通常比普通小分子具有更高的分子量、更多的可旋转键和更大的极性表面积。即使体外结合实验显示三元复合物能够形成，如果分子不能进入细胞或无法达到足够的细胞内游离浓度，也难以产生有效降解。

细胞实验结果还会受到下列因素影响：

         ①目标蛋白和E3连接酶的表达水平；

         ②药物摄取与外排；

         ③PROTAC的细胞内稳定性；

         ④目标蛋白的合成和更新速度；

         ⑤泛素—蛋白酶体系统的功能状态。

         因此，PROTAC的降解数据需要与细胞类型、处理浓度、处理时间和检测方法同时报告。

4.4 Hook效应

         部分PROTAC在高浓度下会出现Hook效应，即浓度继续升高，目标蛋白降解反而减弱。

低浓度

三元复合物数量不足 → 降解较弱

适宜浓度

目标蛋白–PROTAC–E3三元复合物增加 → 降解增强

过高浓度

目标蛋白–PROTAC和PROTAC–E3二元复合物大量形成 → 完整三元复合物比例可能下降 → 降解减弱

         Hook效应并非所有PROTAC都会出现，其程度取决于两个配体的亲和力、三元复合物协同性以及细胞内目标蛋白和E3连接酶的浓度。实验中需要设置覆盖低、中、高浓度的剂量范围，不能仅检测单一高浓度。

5. PROTAC与传统小分子抑制剂的区别

         半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀）反映化合物产生半数最大抑制效应所需的浓度。PROTAC则需要同时评价降解效力、最大降解程度、降解速度和蛋白恢复过程。

与传统抑制剂相比，PROTAC可能具有三方面特点：

         ①不必持续占据目标蛋白即可产生后续降解；

         ②能够同时消除蛋白的催化功能和非催化功能；

         ③三元复合物的结构差异可能使最终降解选择性高于原始配体的结合选择性。

         但蛋白降解并不必然优于功能抑制。清除整个蛋白可能产生比阻断单一活性更广泛的生物学效应，也可能降低安全范围。是否采用降解策略，应根据目标蛋白的功能、疾病机制和正常组织中的作用进行判断。

6. 如何评价一个PROTAC是否真正有效

         评价PROTAC需要建立连续的证据链：首先证明目标蛋白下降，其次证明下降依赖预期的E3和蛋白酶体，最后确认蛋白下降产生了相应的功能效应。

6.1 浓度—降解关系

6.1.1 DC₅₀

         半数最大降解浓度（half-maximal degradation concentration，DC₅₀）是浓度—降解曲线达到该化合物半数最大降解效应时的浓度。由于部分研究也将DC₅₀表述为使目标蛋白相对对照下降50%的浓度，报告结果时应明确计算方法，并同时注明细胞类型、处理时间、检测方法和拟合模型。

6.1.2 Dmax

         最大降解程度（maximum degradation，Dmax）是指定实验条件和检测范围内能够达到的最大蛋白下降比例。

         DC₅₀反映降解效力，Dmax反映能够达到的降解深度。例如，一个化合物可能在较低浓度下迅速达到最大效应，但Dmax仅为50%；另一个化合物的DC₅₀稍高，却能使目标蛋白下降90%以上。因此，两项指标需要结合分析。

6.1.3 完整的剂量范围

         浓度梯度应覆盖无效浓度、有效浓度和较高浓度。这样既能可靠拟合DC₅₀和Dmax，也能判断高浓度下是否出现Hook效应。

6.2 降解动力学

         时间过程实验应包含以下四类信息：

6.2.1 降解速度

         快速降低蛋白水平说明目标蛋白能够较快进入泛素化和蛋白酶体降解过程，但降解速度不能单独代表最终药效强度。

6.2.2 蛋白恢复

         洗去PROTAC后，目标蛋白的恢复速度取决于蛋白重新合成、残余药物暴露和降解过程是否仍在持续。恢复实验有助于判断降解效应是否明显长于药物处理时间。

6.3 作用机制验证

         目标蛋白水平下降并不能单独证明发生了PROTAC介导的蛋白酶体降解。转录减少、翻译抑制、细胞毒性或其他蛋白降解途径也可能造成相同现象。

机制验证宜采用多种相互独立的证据，围绕以下环节建立作用机制证据链。

① 确认目标蛋白结合依赖性

         加入过量游离目标蛋白配体，观察其是否竞争性阻断降解；也可使用不能结合目标蛋白的结构类似物作为阴性对照。

② 确认E3招募依赖性

         加入过量游离E3配体进行竞争，使用不能结合E3的失活对照，或通过基因敲低、敲除验证所招募E3的必要性。

③ 确认泛素—蛋白酶体依赖性

         使用适当的蛋白酶体抑制剂或Cullin-RING连接酶通路干预方法，观察目标蛋白下降是否被阻断。由于此类处理会广泛影响蛋白稳态，不能只依赖单一抑制剂实验得出结论。有条件时，可在目标蛋白明显下降前检测其泛素化水平是否增加，作为目标蛋白进入泛素化过程的更直接证据。

④ 排除转录变化和非特异性毒性

         同步检测目标蛋白信使核糖核酸、细胞活力、总蛋白水平及应激相关指标，排除转录抑制、严重细胞损伤或非特异性蛋白丢失。

         以溴结构域和额外末端结构域（bromodomain and extra-terminal，BET）家族蛋白降解剂dBET1为例，研究人员利用游离配体竞争、失活立体异构体和CRBN依赖性实验，证明溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）的下降需要同时结合目标蛋白并招募CRBN。

6.4 选择性与功能评价

6.4.1 降解选择性

         早期实验可检测目标蛋白的近缘家族成员，并根据所用E3配体检测可能受影响的已知底物；对于CRBN型PROTAC，还应关注CRBN配体可能诱导的新底物（neosubstrates）。深入研究应采用定量蛋白质组学分析全局蛋白变化。蛋白质组学检测时间不宜过晚。处理时间过长时，大量下游蛋白变化可能掩盖直接降解底物，使直接作用与继发效应难以区分。

6.4.2 功能效应

目标蛋白下降不是实验终点，还需要根据其生物学功能检测相应结果，例如：

         ①下游信号蛋白的磷酸化变化；

         ②靶基因表达；

         ③细胞增殖、凋亡或分化；

         ④细胞迁移、代谢或免疫功能；

         ⑤动物模型中的药效和耐受性。

         完整PROTAC应与原始目标蛋白配体、失活对照和溶剂对照进行比较，从而区分蛋白降解、直接功能抑制和非特异性效应。

7. PROTAC的适用情况与主要限制

7.1 适合采用PROTAC的研究情况

7.1.1 需要同时消除催化功能和非催化功能

         当目标蛋白既具有酶活性，又承担支架组装或蛋白相互作用功能时，降解整个蛋白可能比抑制单一活性位点更充分。

7.1.2 缺乏可直接抑制的功能口袋

         某些蛋白缺少适合传统小分子阻断的催化口袋，但仍具有能够被配体识别的蛋白表面。此时，该配体可以作为目标蛋白招募基团，用于构建PROTAC。

7.1.3 需要快速降低蛋白水平研究其功能

         与基因敲除相比，PROTAC可以在较短时间内降低蛋白水平，有助于观察急性蛋白缺失效应，并减少长期遗传补偿对结果的影响。经典PROTAC仍然通常需要一个能够直接结合目标蛋白的配体。因此，它扩大的是可干预蛋白和可利用配体的范围，并没有消除配体发现的要求。

7.2 PROTAC开发中的主要限制

7.2.1 分子理化性质

         PROTAC通常具有较高分子量、较多可旋转键和较大极性表面积，容易出现水溶性不足、细胞通透性较低、口服吸收不稳定或代谢稳定性不足等问题。连接子优化需要同时考虑三元复合物构象和体内药代性质，不能只追求细胞实验中的低DC₅₀和高Dmax。

7.2.2 E3连接酶和细胞环境依赖性

         PROTAC的作用依赖相应E3连接酶及其复合物组分。E3表达不足、亚细胞定位不匹配或复合物功能受损，均可能降低降解效果。长期处理还可能选择出E3复合物缺失、突变或表达下调的耐药细胞。

         因此，开发不同E3招募体系有助于扩大适用组织，并降低单一E3依赖带来的限制。

7.2.3 选择性和安全性

         PROTAC可能降解原始配体能够结合的其他蛋白，也可能因形成新的三元复合物而产生难以仅根据二元结合谱预测的非预期底物。此外，PROTAC降低的是整个蛋白水平。若目标蛋白在正常组织中承担重要结构或调控功能，持续或过度清除可能产生不同于可逆抑制的不良作用。

         评价PROTAC时不仅要关注降解强度，还要确定适宜的降解深度、持续时间、组织分布和蛋白质组选择性。

8. PROTAC技术的重要发展节点

8.1 全小分子PROTAC的形成

         2015年，dBET1通过招募CRBN降解BET家族蛋白；同期，VHL招募型小分子PROTAC在细胞和动物实验中证明了目标蛋白降解以及分子周转的可行性。

8.2 三元复合物结构得到解析

         2017年的BRD4–MZ1–VHL结构研究说明，三元复合物并非两个二元复合物的简单组合。目标蛋白与E3连接酶之间形成的新生接触，可以决定复合物稳定性和降解选择性。

8.3 异双功能降解剂获得监管批准

         2026年5月1日，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准VEPPANU（vepdegestrant），用于治疗经FDA授权检测确认携带ESR1突变、雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阴性，且在至少一线内分泌治疗后疾病进展的晚期或转移性乳腺癌成人患者。

         Vepdegestrant是一种异双功能蛋白降解剂，可同时结合ER和CRBN，诱导CRBN介导的ER多聚泛素化及蛋白酶体降解，是首个获得FDA批准的PROTAC药物。

9. 蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）研究相关代表性化学品分类与应用

表1 PROTAC及相关靶向蛋白降解剂

表2 PROTAC分子设计相关目标蛋白配体与E3招募配体

表3 PROTAC合成用配体—连接子偶联物与通用连接子

表4 PROTAC及靶向配体阴性对照

表5 PROTAC作用机制与蛋白稳定性验证相关试剂

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参考文献

[1] Sakamoto KM, Kim KB, Kumagai A, et al. Protacs: Chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001;98(15):8554-8559. doi:10.1073/pnas.141230798.

[2] Winter GE, Buckley DL, Paulk J, et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381. doi:10.1126/science.aab1433.

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[9] U.S. Food and Drug Administration. FDA approves vepdegestrant for ER-positive, HER2-negative, ESR1-mutated advanced or metastatic breast cancer. Published May 1, 2026.

[10] U.S. Food and Drug Administration. VEPPANU (vepdegestrant) tablets: Prescribing Information. Initial U.S. approval: 2026.

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