1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立哺乳动物细胞CRISPR/Cas9编辑后G418筛选、单克隆分离、扩增及稳定株维持的常规流程，适用于携带新霉素抗性基因（neo）的CRISPR/Cas9载体或共转染体系。该方法主要用于富集成功导入筛选载体的细胞群体，并为后续单克隆建立及目标位点验证提供基础。

1.2 方法原理

（1）G418为氨基糖苷类抗生素，可抑制真核细胞蛋白质合成。

（2）当细胞表达neo基因编码的氨基糖苷3'-磷酸转移酶后，可使G418失活，从而在筛选压力下存活。

（3）未成功导入或未有效表达neo的细胞在G418存在条件下会逐渐死亡，因此可利用G418对转染阳性细胞进行富集。

（4）G418筛选本质上是对载体导入阳性细胞的筛选，而不是对目标编辑正确细胞的直接判定，因此后续仍需结合PCR和测序验证目标位点。

1.3 实验设计要点

（1）G418筛选浓度具有明显细胞系特异性，正式实验前必须建立致死曲线。

（2）筛选开始时细胞应处于活跃增殖状态，建议起始融合度控制在20%～25%。

（3）转染后应设置恢复期，以保证Cas9、sgRNA及neo蛋白充分表达。

（4）正式筛选时应低密度传代，以便抗性克隆形成并分离。

2 常见细胞系G418浓度参考

表1 常见哺乳动物细胞系G418筛选与维持浓度参考

        上述浓度仅作为预实验起始范围，正式应用浓度应以本实验室致死曲线结果为准。

3 材料与试剂

3.1 主要材料

（1）目标哺乳动物细胞系。

（2）含neo筛选元件的CRISPR/Cas9质粒，或相应共转染质粒体系。

（3）24孔板、6孔板、培养皿、培养瓶。

（4）克隆环或无菌枪头。

（5）血球计数板或自动细胞计数仪。

（6）倒置显微镜。

3.2 主要试剂

（1）完全培养基。

（2）G418储备液或工作液。

（3）含neo筛选元件的CRISPR/Cas9质粒，或相应共转染质粒体系。

（4）转染体系：根据细胞类型选择脂质体转染、电转体系或病毒递送体系。

（5）PBS。

（6）胰酶或细胞解离液。

（7）台盼蓝染液。

（8）基因组DNA提取试剂。

（9）PCR扩增试剂。

（10）测序相关试剂或测序服务。

4 G418致死曲线建立

4.1 目的

        致死曲线用于确定在7～10 d内使未转染细胞全部死亡的最低G418浓度，该浓度作为后续正式筛选浓度。

4.2 细胞铺板

（1）将目标细胞接种于24孔板。

（2）控制次日细胞融合度约为20%～25%。

（3）每个浓度至少设置重复孔，并设置不加G418对照孔。

4.3 G418梯度设置

        次日以完全培养基配制G418浓度梯度。常用起始浓度可设为0、100、200、400、600、800、1000、1200 μg/mL，必要时可根据细胞系特点进一步细化。

4.4 加药与观察

（1）弃去原培养基，加入对应浓度的G418选择培养基。

（2）每日镜下观察细胞状态，记录圆缩、脱落、裂解等毒性表现。

（3）每2～3 d更换一次含相同浓度G418的新鲜培养基。

4.5 终点判定

        培养7～10 d后，确定能使未转染细胞全部死亡的最低G418浓度。该浓度作为正式筛选浓度。

5 CRISPR/Cas9编辑细胞的G418正式筛选

5.1 转染

        按照所选转染体系完成CRISPR/Cas9-neo质粒或共转染体系导入。若采用脂质体转染，应优化DNA用量、转染试剂比例及细胞密度；若采用电转，应优化电压、脉冲时间和缓冲体系；若采用病毒递送，应明确感染复数及感染时间。

5.2 恢复期

        转染后先在不含G418的完全培养基中培养48～72 h，使细胞恢复并表达Cas9、sgRNA及neo蛋白。

5.3 开始筛选

（1）恢复期结束后，将细胞低密度传代至新培养器皿。

（2）常用传代比例为1:10或1:20，以便后续抗性克隆有足够生长空间。

（3）加入预先确定的最适G418筛选浓度培养基。

5.4 维持筛选

（1）每3～4 d更换一次含G418的新鲜培养基。

（2）持续观察未转染细胞死亡情况及抗性克隆形成。

（3）多数细胞系在1～3周内可出现边界清楚的抗性克隆。

6 单克隆分离与扩增

6.1 克隆挑取时机

        当培养皿中出现清晰、相互分离且大小适中的抗性克隆后，即可进行单克隆分离。若克隆过密，应重新优化铺板密度或筛选条件。

6.2 分离方法

（1）可使用克隆环配合局部消化挑取单克隆。

（2）也可使用无菌枪头人工挑取单个克隆。

（3）将每个克隆分别转入新的24孔板中扩增培养。

（4）扩增阶段继续维持G418筛选压力。

6.3 扩增培养

        单克隆恢复生长后，逐步扩大培养体积，并同步记录克隆编号、挑取日期及培养状态。

7 编辑结果验证

7.1 分子验证

        当单克隆扩增至足够数量后，提取基因组DNA并进行PCR扩增，再结合Sanger测序或其他分子方法确认目标位点是否发生预期编辑。

7.2 稳定株维持

        确认编辑正确后，稳定株可在较低浓度G418中维持培养。维持浓度通常为正式筛选浓度的50%左右。

8 结果判读要点

8.1 致死曲线

（1）不加G418对照孔应保持正常生长。

（2）随着G418浓度升高，细胞死亡速度应逐渐加快。

（3）最适筛选浓度应同时满足未转染细胞全部死亡和抗性细胞可存活扩增两项要求。

8.2 正式筛选

（1）若加药后全部细胞迅速死亡且无克隆形成，应考虑G418浓度过高、恢复期不足或转染效率过低。

（2）若未转染细胞长时间大面积存活，应考虑G418浓度过低或培养基更换频率不足。

（3）若抗性克隆形成后不能稳定扩增，应评估细胞本身耐受性、neo表达水平及筛选压力是否过强。

9 关键控制点

9.1 细胞状态

        G418筛选适用于活跃分裂细胞。细胞状态差、过度融合或存在污染均会明显降低筛选效率。

9.2 载体设计

        若CRISPR/Cas9元件与neo不在同一表达体系中，需重点关注共转染效率及共表达比例，否则易出现筛选阳性但编辑阴性的情况。

9.3 恢复期设置

        恢复期过短会导致neo表达不足，恢复期过长则会增加未转染细胞背景。

9.4 筛选压力维持

        更换培养基不及时会降低选择压力，影响抗性克隆纯度。

10 常见问题与原因分析

10.1 致死曲线不清晰

（1）细胞铺板密度过高。

（2）G418梯度设置过窄。

（3）培养基更换不及时。

（4）观察时间不足。

10.2 无抗性克隆形成

（1）转染效率低。

（2）恢复期不足。

（3）G418浓度过高。

（4）细胞对外源基因表达耐受性差。

10.3 假阳性较多

（1）G418浓度偏低。

（2）正式筛选开始过晚。

（3）筛选培养基更换频率过低。

10.4 单克隆混杂

（1）铺板密度过高。

（2）克隆挑取过晚。

（3）挑取操作不彻底。

11 质量控制

11.1 预实验控制

（1）每个新细胞系均应重新建立G418致死曲线。

（2）更换培养体系、血清批次或培养条件后，必要时应重新验证筛选浓度。

11.2 正式筛选控制

（1）设置未转染加药对照。

（2）设置转染不加药对照。

（3）必要时设置空载体neo对照，以区分筛选效应与编辑效应。

11.3 克隆验证控制

（1）每个单克隆均应独立编号。

（2）测序前宜保留冻存备份。

（3）G418筛选阳性与目标编辑阳性应分别判读。

12 安全与操作规范

12.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）所有细胞培养、转染与加药步骤均应在无菌条件下进行。

12.2 废弃物处理

（1）含G418培养基废液应分类收集。

（2）细胞培养耗材、枪头和培养板应按生物污染废弃物规范处理。

（3）PCR和测序样本应与细胞培养区域分开操作，避免交叉污染。

13 相关试剂与材料选型

表2 G418筛选CRISPR/Cas9编辑细胞相关试剂与材料选型

更多相关文章，详见下方：

[1] 常用哺乳动物细胞抗性筛选体系比较：嘌呤霉素、G418、潮霉素B与杀稻瘟菌素