1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立 Puchtler 鞣酸-偶氮荧光桃红法肌纤维染色的常规操作流程，适用于石蜡组织切片中肌纤维与胶原纤维的鉴别观察，可用于平滑肌、骨骼肌、心肌相关组织的形态学研究，也可用于乳腺、皮肤等含肌上皮细胞成分组织的辅助显示。

1.2 方法原理

（1）该方法属于顺序性鉴别染色体系，通过苏木素核染、鞣酸分化、磷钼酸处理及偶氮荧光桃红复染，使不同组织成分获得稳定色差。

（2）Lea 苏木素主要用于细胞核染色，使细胞核呈蓝色，便于后续组织结构辨认。

（3）鞣酸和磷钼酸处理后，胶原纤维与肌纤维对偶氮荧光桃红的结合能力出现差异，最终使肌纤维和肌上皮细胞呈玫瑰红色，胶原纤维呈黄色。

1.3 染色质量要求

（1）肌纤维和肌上皮细胞着色鲜明，呈稳定玫瑰红色。

（2）胶原纤维分色清楚，呈黄色。

（3）细胞核蓝染清晰，背景较干净，组织轮廓完整。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）肌组织相关石蜡切片。

（2）乳腺组织石蜡切片。

（3）皮肤组织石蜡切片。

（4）其他需区分肌纤维与胶原纤维的常规组织切片。

2.2 主要试剂

（1）Bouin 固定液、Carnoy 固定液或中性福尔马林。

（2）95% 乙醇。

（3）无水乙醇。

（4）Lea 苏木素染色液。

（5）鞣酸分化液。

（6）磷钼酸分化液。

（7）偶氮荧光桃红染色液。

（8）酸性醇分化液。

（9）蒸馏水。

（10）二甲苯或脱蜡透明液。

（11）中性树胶。

2.3 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）染色缸。

（3）镊子、吸水纸。

（4）石蜡切片机。

（5）烤片设备。

（6）显微镜。

3 染液与样本准备

3.1 固定要求

（1）常规组织宜固定于 Bouin 固定液 2～3 h，通常有利于获得较好的染色对比。

（2）Carnoy 固定液或中性福尔马林亦可使用，但部分固定体系可能导致染色偏淡。

（3）同批样本宜尽量采用一致的固定体系和固定时间，以减少染色差异。

3.2 脱水、包埋与切片要求

（1）固定后样本可直接转入 95% 乙醇中，按常规流程脱水、包埋。

（2）石蜡切片厚度建议为 4 μm。

（3）切片厚薄应尽量一致，以提高同批样本染色均一性和结果可比性。

3.3 脱蜡要求

（1）石蜡切片应常规二甲苯或脱蜡透明液脱蜡至水。

（2）脱蜡不充分易导致染色不均或背景发灰。

（3）进入染色步骤前，切片应处于充分水化状态。

4 实验流程

4.1 固定与包埋

（1）常规组织固定于 Bouin 固定液 2～3 h。

（2）固定后直接转入 95% 乙醇中。

（3）按常规流程完成脱水、包埋。

4.2 切片与脱蜡

（1）石蜡切片厚 4 μm。

（2）常规二甲苯或脱蜡透明液脱蜡至水。

4.3 核染色

（1）将切片置于 Lea 苏木素染色液中浸染 8～10 min。

（2）取出后流水冲洗 10 min。

（3）核染应以细胞核清晰蓝染为宜，不宜过浅。

4.4 鞣酸分化

（1）将切片置于鞣酸分化液中处理 10 min。

（2）处理后流水冲洗 1 min。

（3）该步骤有助于后续胶原纤维与肌纤维的差异显色。

4.5 磷钼酸分化

（1）将切片置于磷钼酸分化液中处理 10 min。

（2）处理结束后可直接进入偶氮荧光桃红染色步骤。

（3）该步骤应保持时间稳定，以减少批间分色波动。

4.6 偶氮荧光桃红染色

（1）将切片置于偶氮荧光桃红染色液中浸染 10～15 min。

（2）染色时间可根据组织类型和染色强度适当微调。

（3）以肌纤维着色充分而不过度为宜。

4.7 酸性醇分化

（1）将切片置于酸性醇分化液中分化 3～5 s。

（2）分化程度应控制至切片上多余红色染液基本脱去、肌纤维呈鲜红或玫瑰红色为止。

（3）该步骤为本方法关键控制点之一，不宜分化不足或过度分化。

4.8 脱水、透明与封片

（1）染色完成后用无水乙醇反复脱水多次，并按梯度完成脱水。

（2）转入二甲苯或脱蜡透明液中透明。

（3）滴加中性树胶，覆盖盖玻片，完成封片。

（4）封片后应避免产生气泡，并保持胶液分布均匀。

5 染色结果

5.1 肌纤维与肌上皮细胞

（1）肌纤维呈玫瑰红色。

（2）肌上皮细胞呈玫瑰红色。

5.2 胶原纤维

（1）胶原纤维呈黄色。

（2）胶原纤维与肌纤维之间应具有清晰颜色对比。

5.3 细胞核

（1）细胞核呈蓝色。

（2）核染应能较好显示组织轮廓和细胞定位关系。

6 结果判读要点

6.1 肌纤维判读

（1）肌纤维着色鲜明且连续时，提示肌组织结构保存较好。

（2）肌纤维若着色偏淡，应优先回查固定体系、偶氮荧光桃红染色时间及酸性醇分化程度。

6.2 胶原纤维判读

（1）胶原纤维黄色分布清楚时，有利于观察间质成分与肌组织边界。

（2）若胶原纤维与肌纤维分界不清，应优先检查鞣酸分化和磷钼酸分化步骤。

6.3 肌上皮细胞判读

（1）肌上皮细胞呈玫瑰红色时，有助于在乳腺、皮肤等组织中进行辅助识别。

（2）判读时应结合细胞核位置与组织结构背景综合分析。

7 常见问题与原因分析

7.1 肌纤维着色偏淡

（1）固定体系不理想，尤其未采用 Bouin 固定液时更易出现。

（2）偶氮荧光桃红染色时间不足。

（3）酸性醇分化过度。

7.2 切片整体偏红

（1）酸性醇分化不足。

（2）偶氮荧光桃红染色过深。

（3）脱水前未有效去除多余染液。

7.3 肌纤维与胶原纤维分色不清

（1）鞣酸分化不充分。

（2）磷钼酸分化时间不足或不稳定。

（3）组织固定和切片厚度不一致造成批间差异。

7.4 核染不清

（1）Lea 苏木素染色时间不足。

（2）流水冲洗不充分或过度。

（3）脱蜡不彻底影响核染均一性。

8 应用范围

8.1 肌组织观察

（1）平滑肌相关组织观察。

（2）骨骼肌与心肌相关组织观察。

8.2 结缔组织鉴别

（1）用于区分肌纤维与胶原纤维。

（2）适合观察肌层连续性及间质胶原分布。

8.3 肌上皮相关研究

（1）可显示肌上皮细胞。

（2）适用于乳腺和皮肤等含肌上皮细胞成分组织的形态学研究。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理固定液、酸性醇、二甲苯及染色液时应在通风条件良好的环境下操作。

9.2 废液处理

（1）含固定液、乙醇、二甲苯和染色残液的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品处理规范处置。

10 相关试剂与材料选型

表1 Puchtler鞣酸-偶氮荧光桃红法肌纤维染色相关试剂选型

更多相关文章，详见下方：

[1] 组织切片中胶原纤维、肌纤维与纤维蛋白的染色鉴别方法