部分细胞在体外培养时难以在培养表面稳定黏附，容易出现贴壁缓慢、铺展不足或换液后脱落。采用纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、玻连蛋白和多聚赖氨酸等附着因子处理培养表面，可改善细胞黏附并维持适宜的培养状态。

        关键词：细胞附着因子；细胞外基质；细胞黏附；纤连蛋白；层粘连蛋白；胶原蛋白；玻连蛋白；多聚赖氨酸；表面包被；细胞培养

1 细胞为何贴不牢：细胞外基质与黏附基础

1.1 细胞外基质

        细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是由细胞分泌并分布于细胞外空间的三维大分子网络，主要包括胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖。ECM既为细胞提供结构支撑，也通过细胞表面受体参与黏附、迁移、增殖、分化和存活调控。

1.2 细胞—基质黏附

        多数ECM蛋白可与细胞膜上的整合素及其他黏附受体结合，促进黏着斑形成并连接肌动蛋白细胞骨架。附着因子不仅能够增强细胞与培养表面的结合，还可能改变细胞形态、迁移能力、增殖速度和分化状态。

图1 细胞外基质组成及整合素介导的细胞黏附结构示意图

1.3 细胞贴壁不良的原因

        细胞贴壁不良常与细胞自身分泌ECM不足、培养表面缺少适宜配体、消化过度、细胞活率下降、接种密度不当和无血清培养有关。包被浓度不足、包被不均、气泡残留、表面干燥以及换液冲击过强，也会导致细胞贴壁缓慢或再次脱落。

1.4 附着因子的作用类型

        天然ECM蛋白可提供特异性受体结合位点和生物学信号，适合维持细胞表型；多聚赖氨酸等电荷型材料主要通过静电作用增强物理吸附；复合基质能够同时提供结构、黏附和生长支持，但组成复杂度和批次差异通常较高。

2 天然细胞外基质蛋白类附着因子

2.1 纤连蛋白

（1）作用机制

        纤连蛋白（fibronectin，FN）是分布于血浆、细胞表面和细胞外基质中的大分子糖蛋白，可通过RGD等黏附序列与整合素结合，并与胶原蛋白、蛋白聚糖等ECM成分形成连接。

（2）主要特点

        纤连蛋白能够快速促进细胞贴壁和铺展，适合需要迅速建立细胞—培养表面连接的实验。其生物活性较强，同时可能增强整合素、FAK及相关迁移和增殖信号。

（3）适用细胞与选择

        纤连蛋白常用于成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、间充质细胞和多种肿瘤细胞。研究细胞迁移、侵袭或药物敏感性时，应统一各组包被条件，避免将纤连蛋白本身引起的信号变化误判为处理效应。

2.2 层粘连蛋白

（1）作用机制

        层粘连蛋白（laminin）是基膜的重要组成成分，由α、β和γ链构成，不同链组合可形成具有不同组织分布和受体选择性的层粘连蛋白亚型。

（2）主要特点

        层粘连蛋白可促进细胞黏附、极化、迁移和分化，对神经突生长、干细胞状态维持及上皮组织结构形成具有重要作用。天然层粘连蛋白通常含有多种亚型，而重组层粘连蛋白可以提供更明确的亚型组成。

（3）适用细胞与选择

        层粘连蛋白主要用于神经元、神经干细胞、多能干细胞和上皮细胞。神经细胞培养常将其与多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸联合使用；干细胞长期培养则应根据细胞类型选择适宜的重组层粘连蛋白亚型。

2.3 Ⅰ型胶原蛋白

（1）作用机制

        Ⅰ型胶原蛋白是皮肤、骨、肌腱和多种结缔组织中的主要纤维胶原，可形成纤维状支架并与胶原结合型整合素相互作用。胶原分子的三螺旋结构、原纤维装配方式和交联状态共同决定其力学性质及细胞结合能力。

（2）主要特点

        Ⅰ型胶原蛋白适用范围较广，既可用于二维培养表面包被，也可形成凝胶用于三维培养、胶原夹层培养和组织工程模型。

（3）适用细胞与选择

        Ⅰ型胶原蛋白常用于成纤维细胞、平滑肌细胞、肝细胞、成骨细胞和多种原代细胞。对于依赖基膜结构的上皮细胞和内皮细胞，Ⅳ型胶原蛋白或层粘连蛋白通常更接近其天然微环境。

2.4 Ⅱ型胶原蛋白

（1）作用机制

        Ⅱ型胶原蛋白是透明软骨细胞外基质中的主要胶原成分，可为软骨细胞提供具有组织特异性的黏附环境。

（2）主要特点

        Ⅱ型胶原蛋白主要用于模拟软骨组织微环境，适用范围相对集中，不属于常规广谱型培养表面包被材料。

（3）适用细胞与选择

        Ⅱ型胶原蛋白适用于软骨细胞、软骨祖细胞及软骨分化体系。研究软骨细胞表型维持、软骨基质合成和软骨损伤修复时，其组织相关性通常优于Ⅰ型胶原蛋白。

2.5 Ⅲ型胶原蛋白

（1）作用机制

        Ⅲ型胶原蛋白常与Ⅰ型胶原蛋白共同存在于皮肤、血管和网状结缔组织中，可参与纤维网络形成及细胞—基质相互作用。

（2）主要特点

        Ⅲ型胶原蛋白形成的基质通常较柔韧，适合模拟血管、皮肤和组织修复过程中的间质环境，实际应用中常与Ⅰ型胶原蛋白联合使用。

（3）适用细胞与选择

        Ⅲ型胶原蛋白可用于成纤维细胞、血管相关细胞和间质细胞研究。重组Ⅲ型胶原蛋白若具有无菌过滤、低内毒素和较高纯度，可用于细胞培养基质及细胞—基质相互作用研究，但作为培养板包被材料时仍需通过预实验确定工作浓度和黏附效果。

2.6 Ⅳ型胶原蛋白

（1）作用机制

        Ⅳ型胶原蛋白不形成典型长纤维，而是在基膜中构建网状支架，并与层粘连蛋白、巢蛋白和蛋白聚糖共同维持基膜结构。

（2）主要特点

        Ⅳ型胶原蛋白更接近天然基膜环境，有利于基底侧黏附、细胞极性建立和屏障结构形成。

（3）适用细胞与选择

        Ⅳ型胶原蛋白适用于上皮细胞、内皮细胞、肾小球相关细胞及其他基膜依赖型细胞。研究细胞极化、屏障功能和基底膜相互作用时，通常优先于Ⅰ型胶原蛋白。

2.7 玻连蛋白

（1）作用机制

        玻连蛋白（vitronectin，VN）是存在于血液和细胞外基质中的糖蛋白，可通过RGD序列与整合素结合，并参与细胞黏附、迁移及多种蛋白质相互作用。

（2）主要特点

        玻连蛋白包被操作相对简单。重组玻连蛋白组成明确、批次一致性较好，适合无血清及化学成分限定培养；人血浆来源玻连蛋白具有天然构象，但需关注来源、无菌和内毒素指标。

（3）适用细胞与选择

        玻连蛋白主要用于胚胎干细胞、诱导多能干细胞和部分无血清培养细胞。需要提高体系可控性和重复性时，可优先选择重组玻连蛋白。

2.8 弹性蛋白

（1）作用机制

        弹性蛋白（elastin）是血管、肺、皮肤和其他弹性组织中的结构成分，可与胶原纤维共同维持组织的弹性和力学性质。

（2）主要特点

        弹性蛋白单独作为常规培养表面包被材料的应用少于胶原蛋白和纤连蛋白，更多以弹性蛋白衍生肽、复合支架或水凝胶形式使用。

（3）适用细胞与选择

        弹性蛋白相关材料可用于血管平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和软组织工程研究。选择时应重点考虑材料的细胞相容性、无菌性、内毒素和交联方式，不能仅根据“弹性蛋白”名称判断其可直接用于细胞包被。

2.9 明胶

（1）作用机制

        明胶（gelatin）由胶原蛋白部分水解形成，保留部分胶原来源的细胞黏附序列，但缺少完整胶原蛋白的三螺旋结构和纤维组织。

（2）主要特点

        明胶成本较低、配制方便，适合常规细胞培养和初步包被条件筛选。不同明胶产品在来源、凝胶强度、内毒素和级别方面差异较大。

（3）适用细胞与选择

        明胶常用于HEK293、Vero等常规传代细胞以及部分干细胞培养。用于哺乳动物细胞培养时，应优先选择低内毒素产品，并通过无菌过滤或其他适宜方式进行无菌配制；照相级、化学纯、微生物学用和普通试剂级明胶不宜直接作为细胞培养包被产品推荐。

3 电荷型与合成类附着因子

3.1 多聚-L-赖氨酸

（1）作用机制

        多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）是带正电荷的合成多肽，可增强带负电荷的培养表面与细胞膜成分之间的静电吸附。

（2）主要特点

        PLL起效快、使用方便，但不提供特异性整合素结合位点，也不能替代天然ECM蛋白提供的生物学信号。不同分子量产品在表面吸附强度、溶液黏度和包被稳定性方面存在差异。

（3）适用细胞与选择

        PLL适用于神经细胞、弱贴壁细胞、玻璃爬片和短期细胞固定。细胞长期培养或需要维持特定表型时，可与层粘连蛋白等ECM蛋白联合使用。

3.2 多聚-D-赖氨酸

（1）作用机制

        多聚-D-赖氨酸（poly-D-lysine，PDL）与PLL具有相似的正电荷吸附作用，但由D型氨基酸构成。

（2）主要特点

        PDL不易被多数细胞分泌的蛋白酶降解，形成的包被层通常比PLL更加稳定，适合培养周期较长的实验。

（3）适用细胞与选择

        PDL主要用于原代神经元、神经细胞系和长期神经培养，常与层粘连蛋白联合使用。低分子量产品较易溶解和清洗，高分子量产品通常具有更强的表面吸附能力，但浓度过高可能影响细胞状态。

3.3 多聚-L-鸟氨酸

（1）作用机制

        多聚-L-鸟氨酸（poly-L-ornithine，PLO）通过正电荷改变培养表面性质，增强细胞与基底之间的静电吸附。

（2）主要特点

        PLO常作为神经分化培养的基础包被层，能够改善细胞初始贴壁，但单独使用时提供的特异性生物信号有限。

（3）适用细胞与选择

        PLO适用于神经元、神经干细胞、神经前体细胞及多能干细胞神经分化，通常与层粘连蛋白或其他ECM蛋白联合使用。

3.4 贻贝源强黏附蛋白类细胞固定剂

（1）作用机制

        Cell-Tak类材料通过较强的非特异性表面黏附作用，将细胞固定在培养板、玻璃或其他实验载体上。

（2）主要特点

        此类材料黏附强、起效快，可以固定本身缺少稳定贴壁能力的细胞，但不能模拟天然ECM环境，也不能提供特异性受体信号。

（3）适用细胞与选择

        Cell-Tak类材料适用于悬浮细胞、血细胞和难贴壁细胞的短期成像、免疫染色及功能检测，一般不作为长期细胞培养的首选附着因子。

3.5 合成黏附肽

（1）作用机制

        合成黏附肽通常来源于ECM蛋白中的功能序列，如RGD、YIGSR和IKVAV，可固定于培养表面或水凝胶中，为细胞提供特定受体结合位点。

（2）主要特点

        合成黏附肽组成明确、批次差异较小，便于调节配体密度和研究特定受体—配体关系。

（3）适用细胞与选择

        合成黏附肽适用于无动物源培养、组织工程和黏附机制研究。单一短肽难以完全复制天然ECM蛋白的多结构域功能，必要时需联合多种肽段或其他基质成分。

4 复合基质与成分限定培养材料

4.1 基底膜提取物

（1）组成

        基底膜提取物通常含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、巢蛋白、蛋白聚糖及多种生长调节成分。

（2）主要特点

        基底膜提取物具有较强的生物活性和成胶能力，可支持细胞黏附、增殖、分化及三维结构形成，但组成较复杂，可能存在批次差异。

（3）适用细胞与选择

        基底膜提取物常用于类器官、肿瘤细胞、干细胞和三维培养。研究特定信号通路或建立高度标准化体系时，应考虑使用重组ECM蛋白或成分明确的合成基质。

4.2 胶原蛋白与层粘连蛋白复合包被

（1）组合原理

        胶原蛋白提供结构支撑和胶原受体结合位点，层粘连蛋白提供基膜相关黏附及分化信号。

（2）主要特点

        复合包被可同时改善细胞初始黏附和表型维持，但组分增加也会扩大实验变量。

（3）适用细胞与选择

        该组合适用于上皮细胞、神经细胞和部分原代细胞。应先比较单一组分与复合组分，确认联合包被能够产生明确优势后再用于正式实验。

4.3 多聚赖氨酸与层粘连蛋白复合包被

（1）组合原理

        多聚赖氨酸通过静电作用形成基础吸附层，层粘连蛋白进一步提供特异性黏附受体结合和神经生长信号。

（2）主要特点

        该组合通常比单独使用多聚赖氨酸更有利于神经细胞长期存活、铺展和神经突形成。

（3）适用细胞与选择

        该组合广泛用于神经元、神经干细胞和神经分化培养，通常先使用多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸处理培养表面，再进行层粘连蛋白包被。

4.4 重组ECM蛋白

（1）组成特点

        重组ECM蛋白采用明确的蛋白序列和表达体系，可提供特定亚型、蛋白片段或功能结构域。

（2）主要特点

        重组产品通常具有较好的批次一致性，可选择无动物源、无菌过滤和低内毒素制备形式，适合无血清和成分限定培养体系。

（3）适用细胞与选择

        重组纤连蛋白、重组层粘连蛋白、重组玻连蛋白及重组胶原蛋白可用于细胞培养基质和细胞—基质相互作用研究。带标签或仅包含蛋白片段的产品不一定具有与天然全长蛋白相同的包被性能，应根据生物活性、结构组成和推荐用途进行选择。

4.5 动物源与无动物源基质

（1）动物源基质

        动物源胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白和基底膜提取物使用经验丰富、成本相对较低，但可能存在批次差异、动物源风险和成分不完全明确等问题。

（2）无动物源基质

        重组ECM蛋白和合成黏附肽组成相对明确，更适合无血清培养、细胞治疗工艺开发和需要严格控制实验变量的研究。

（3）选择原则

        基础研究可根据细胞状态、实验目的和预算选择适宜材料；对批次一致性、无动物源和后续转化要求较高时，应优先考虑重组或合成基质。模拟干细胞生态位的复合微载体还可同时提供基质结构、细胞包埋和局部微环境支持。

5 不同细胞如何选择附着因子

5.1 成纤维细胞、内皮细胞与肿瘤细胞

        成纤维细胞可优先选择Ⅰ型胶原蛋白或纤连蛋白；内皮细胞可根据组织来源选择纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白或层粘连蛋白；肿瘤细胞需要改善贴壁时可使用纤连蛋白或胶原蛋白，但应注意ECM对迁移和药物敏感性的影响。

5.2 上皮细胞

        上皮细胞天然依赖基膜环境，通常优先选择Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白或二者复合包被。研究极化、屏障功能或细胞连接时，不应只根据初始贴壁率选择Ⅰ型胶原蛋白。

5.3 神经细胞

        原代神经元和神经前体细胞可使用PDL、PLL或PLO形成基础包被层，再使用层粘连蛋白促进受体介导的黏附和神经突生长。短期固定可单独使用多聚赖氨酸，长期培养更适合联合包被。

5.4 胚胎干细胞与诱导多能干细胞

        传统培养可使用明胶或基底膜提取物，化学成分限定体系可选择重组玻连蛋白或适宜的重组层粘连蛋白。评价时应同时观察贴壁效率、克隆形态、干性标志物和分化倾向。

5.5 肝细胞、软骨细胞和平滑肌细胞

        肝细胞通常使用Ⅰ型胶原蛋白，也可采用胶原夹层培养；软骨细胞优先选择Ⅱ型胶原蛋白；平滑肌细胞可选择Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白。长期培养还应考虑基质硬度和三维结构对细胞表型的影响。

5.6 常规传代细胞

        HEK293、Vero等细胞通常可在组织培养处理表面直接贴壁，贴壁不稳定时可先使用明胶、PLL或低浓度Ⅰ型胶原蛋白。若细胞突然出现普遍脱落，应先排查消化过度、培养基、血清、接种密度和污染问题。

5.7 悬浮细胞与短期固定

        悬浮细胞通常缺少稳定的整合素介导黏附，仅靠ECM蛋白不一定能够长期转为贴壁培养。显微成像和短期检测可使用Cell-Tak、PLL或PDL固定，长期培养则需重新评价细胞受体表达和培养条件。

5.8 不同培养体系

        含血清培养基可提供一定量的黏附相关蛋白，部分细胞无需额外包被；无血清体系通常更依赖预包被；化学成分限定培养应优先选择重组玻连蛋白、重组层粘连蛋白或合成黏附肽。

5.9 常用附着因子选择比较

6 包被条件的建立与优化

6.1 储液与稀释

        附着因子应按产品要求缓慢解冻并分装保存，避免反复冻融和剧烈振荡。常用稀释液为无菌PBS或无血清培养基，不同来源、亚型和分子量产品的工作浓度不能直接套用。

6.2 工作浓度

        首次使用应设置浓度梯度。Ⅰ型胶原蛋白可从5～20 μg/mL、纤连蛋白可从1～5 μg/mL范围开始预实验，层粘连蛋白、玻连蛋白和聚氨基酸类材料则应根据具体产品说明和目标细胞进行优化。

6.3 包被液用量

        包被液应完全覆盖培养表面，96孔板可使用50～100 μL/孔，6孔板可使用约800 μL/孔，T25培养瓶可使用约2.5 mL。实际用量可根据培养面积和器皿形状调整。

6.4 孵育条件

        快速包被可采用室温或37℃孵育，对基质要求较高的原代细胞和干细胞可采用4℃过夜包被。多聚赖氨酸类材料通常可在室温处理，ECM蛋白的孵育温度和时间应以产品说明为准。

6.5 洗涤与防干燥

        是否洗涤取决于附着因子类型，电荷型材料通常需要去除未结合成分，部分ECM蛋白可在吸除多余溶液后直接使用。包被表面在接种前应保持湿润，避免蛋白层干燥、变性或分布不均。

6.6 细胞接种

        应选择状态良好且处于适宜生长阶段的细胞。消化时间不宜过长，以免破坏整合素等表面黏附分子；接种密度过低可能延长贴壁时间，接种密度过高则会掩盖不同包被条件之间的差异。

6.7 联合包被

        联合包被应明确各组分的功能，例如PDL负责增强基础吸附，层粘连蛋白负责提供神经细胞黏附和分化信号。若单一附着因子已能满足培养要求，不宜增加不必要的组分。

7 细胞黏附效果的评价

7.1 形态观察

        应同时观察贴壁细胞数量、铺展面积、细胞突起、细胞间连接和脱落情况。细胞仅停留在培养表面但未充分铺展，可能只是暂时性吸附，不能视为已经形成稳定黏附。

7.2 结晶紫比色法

        贴壁细胞经固定和结晶紫染色后，可溶解结合染料并测定吸光度。该方法成本较低，适合多孔板批量筛选，但不能区分存活细胞与死亡细胞。细胞黏附实验中应统一接种量、孵育时间、洗涤力度和染色条件。

7.3 钙黄绿素-AM荧光法

        钙黄绿素-AM可进入活细胞并被胞内酯酶水解形成绿色荧光，适合活细胞定量和成像。细胞黏附率可通过贴壁细胞荧光值与接种总细胞荧光值的比值计算。

7.4 图像与实时检测

        显微图像计数、自动成像和实时阻抗检测可用于分析细胞数量、铺展面积及黏附过程。实时阻抗信号同时受到细胞数量、大小和形态影响，应结合终点显微成像进行解释。

7.5 初始黏附与长期培养

        初始黏附通常在接种后数十分钟至数小时内评价，长期培养则需观察数天内的细胞存活、增殖、表型和脱落情况。附着因子对初始贴壁和长期表型的作用可能并不一致。

8 贴壁异常的排查与优化

8.1 细胞持续漂浮

        应检查附着因子是否适配目标细胞、包被浓度是否足够以及孵育条件是否合理。应优先调整基质类型，不宜只通过不断提高原有附着因子浓度解决。

8.2 局部贴壁不均

        细胞呈环状、团块状或局部聚集，通常与包被液未完全覆盖、气泡残留、培养板放置不平或包被表面干燥有关。

8.3 消化后难以贴壁

        长时间胰酶处理可能破坏细胞表面的黏附受体，应缩短消化时间、及时终止消化并减少过度吹打。对单细胞解离敏感的干细胞和原代细胞还应选择适宜的温和解离方法。

8.4 换液后脱落

        初始贴壁阶段的细胞连接尚不稳定，换液时应沿孔壁缓慢操作，避免液流直接冲击细胞层，并根据细胞贴壁速度合理设置首次换液时间。

8.5 贴壁增加但表型异常

        细胞贴壁数量增加但出现过度铺展、扁平化、突起减少或分化标志改变，说明包被材料可能不适合目标表型，应同时评价细胞形态、活率和功能指标。

8.6 天然基质批次差异

        动物源ECM蛋白和基底膜提取物可能存在活性及组分差异，更换批次时应进行平行验证。对重复性要求较高的实验，可优先选择重组ECM蛋白或合成黏附肽。

9 细胞附着与培养表面包被相关产品

        附着因子的选择应结合细胞来源、天然微环境、培养基组成和目标表型。通过匹配基质类型、优化包被条件并同步评价细胞形态与功能，可建立稳定、可重复的细胞培养体系。

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