导读

         多肽合成的难点，往往不只在肽键能否形成，还在于每一步反应后的中间体能否溶解、能否分离、能否继续推进。对于一些疏水性较强、序列较长或容易聚集的多肽，反应本身可能可以完成，但后处理和纯化会变得复杂。

         标签辅助液相肽合成（Tag-Assisted Liquid-Phase Peptide Synthesis，TAG-LPPS）正是针对这类问题发展出的合成策略。它通过在肽链上临时引入可脱除的化学标签，使肽中间体在反应阶段有机会保持较好的溶解性，在后处理阶段更容易通过沉淀、过滤、洗涤或相分离进行处理。合成完成后，标签被脱除，释放目标多肽。

         这类方法的价值是帮助研究人员同时解决三个实际问题：中间体如何溶解，反应后如何分离，路线如何放大。

1. 多肽合成的难点不只在偶联反应

         多肽合成的核心反应是氨基酸之间形成酰胺键。当保护基、缩合剂、碱和溶剂选择合理时，许多偶联反应在小试条件下一般都可以进行。但一条合成路线是否真正可用，还取决于反应完成后的中间体是否容易处理。

         随着肽链延长，中间体的物理化学性质会明显变化。疏水残基增加时，中间体可能在常用有机溶剂中溶解性下降；极性基团较多时，萃取和分离可能变得困难；序列容易形成聚集时，反应体系可能出现浑浊、析出或偶联不完全。

         这些问题会进一步影响后续链延伸和中间体处理，主要体现在以下几个方面：

①中间体溶解不充分，反应体系不均一，偶联效率可能下降；

②偶联不完全时，未完全延伸的链段可能继续进入后续步骤，形成缺失序列杂质；

③目标中间体、副产物和未反应物性质接近时，分离和纯化难度增加；

④小试中可用的柱层析或制备型高效液相色谱，在放大时可能带来较高的成本和操作压力。

         因此，多肽路线设计不能只考虑“氨基酸能否接上”，还要提前考虑“接上之后能否溶解、能否分离、能否继续推进”。

2. 传统溶液相肽合成、固相肽合成和 TAG-LPPS 都存在适用边界

         传统溶液相肽合成是在溶液中进行肽链延伸。其优势在于，当肽中间体能够保持良好溶解时，反应体系通常较为均一，中间体便于取样、表征和过程控制，试剂用量也相对容易调节，因此在部分片段合成和放大研究中具有应用价值。但传统溶液相路线也存在明显限制：每一步偶联或脱保护后，通常都需要对中间体进行分离、纯化或至少进行有效后处理。随着肽链延长，中间体的溶解性、极性和聚集倾向不断变化，分离和纯化难度往往会逐步增加。

         固相肽合成（Solid-Phase Peptide Synthesis，SPPS）是将起始氨基酸连接到固相树脂上，再通过反复脱保护和偶联完成肽链延伸。其优势是操作流程清晰，过量试剂和小分子副产物可通过洗涤除去，广泛用于研发、小规模制备和自动化合成。但 SPPS 也并非适用于所有序列和所有规模。对于某些长肽、疏水肽或容易聚集的序列，固相体系可能受到树脂负载量、固液传质、偶联不完全、试剂过量使用、溶剂消耗以及放大成本等因素限制。

         TAG-LPPS 是在液相肽合成思路基础上发展出的标签辅助策略。它通过在肽链上临时引入可脱除的化学标签，调节带标签肽中间体在特定溶剂体系中的溶解性和分离行为，从而为部分难溶、难分离、难纯化或需要放大的多肽项目提供另一种路线选择。与传统溶液相路线相比，TAG-LPPS 的核心价值在于：在适用体系中尽量保留液相反应的均一性，同时借助标签将部分中间体处理转化为沉淀、过滤、洗涤或相分离等更便于放大的操作。

         传统溶液相肽合成、SPPS 和 TAG-LPPS 并不是简单的替代关系，而是各有适用场景。具体路线选择需要结合目标序列的溶解性、偶联效率、中间体分离难度、最终脱除条件、纯化要求和放大可行性综合判断。三种合成方式的特点对比如下表所示：

3. 什么是“标签”

在 TAG-LPPS 中，“标签”是一个临时连接到肽链上的化学辅助基团。它也可称为：

         ①可溶性标签（soluble tag）；

         ②疏水性标签（hydrophobic tag）；

         ③化学标签（chemical tag）；

         ④可溶性载体（soluble support）；

         ⑤锚定基团（anchor group）。

         这些名称侧重点不同，但核心作用相同：通过临时改变肽中间体的溶解性和分离行为，使合成过程更容易操作。

         一个合格的标签通常需要满足以下要求。

3.1 能与肽链稳定连接

         标签需要在合成过程中与肽链保持稳定连接，能够耐受后续偶联、脱保护、洗涤和浓缩等操作。许多标签设计在肽链 C 端，也有部分策略可用于其他连接方式。

3.2 能改善肽中间体的溶解性

         标签通过疏水链、芳香结构、硅基结构或其他可调节溶解性的结构单元，改善带标签肽在特定有机溶剂体系中的溶解行为。例如，硅基标签辅助肽合成中，硅基标签可提高肽在环戊基甲醚等有机溶剂中的溶解性，使反应能够在较高浓度下进行。

3.3 能帮助反应后分离

         反应完成后，可以利用标签带来的溶解性差异进行分离。例如，带有疏水标签的肽中间体在部分体系中可在反应溶剂中保持溶解；加入不良溶剂后，其溶解度下降并发生沉淀，从而可通过过滤和洗涤回收目标中间体，并去除过量试剂、小分子副产物和部分可溶性杂质。

         这里的“不良溶剂”是指目标带标签肽中间体在其中溶解度较低的溶剂。加入不良溶剂的目的，是降低目标中间体在混合溶剂体系中的溶解度，使其从溶液中析出。需要注意沉淀只是分离手段，并不等同于纯化完成；如果杂质与目标中间体共同沉淀，仍需要进一步优化洗涤条件或后续精制。

         不同标签的后处理逻辑并不完全相同。疏水苄醇类标签常利用不良溶剂降低带标签肽中间体的溶解度，使其沉淀后通过过滤和洗涤回收；硅基标签（silylated tag，STag）体系则更强调提高带标签肽在环戊基甲醚（cyclopentyl methyl ether，CPME）等有机溶剂中的溶解性，并结合水洗或液液相分离完成中间体处理。

3.4 最终可以脱除

         标签不是目标多肽的一部分。合成完成后，需要通过合适条件将标签脱除，并尽量避免肽链降解、侧链副反应或难除副产物生成。

         TAG-LPPS 中的标签可以概括为：一个可连接、可调节溶解性、可辅助分离、可最终脱除的临时化学基团。

4. 标签辅助液相肽合成主要缓解什么问题

         TAG-LPPS 主要用于缓解多肽中间体在液相合成中的可操作性问题。它的作用可以分为三个环节。

         在反应阶段，标签的作用主要体现在改善或调节带标签肽在特定溶剂体系中的溶解状态，使反应体系更容易保持均一。对于疏水性较强或容易聚集的肽中间体，这一点尤其重要，因为这类中间体在链延伸过程中更容易出现溶解性下降、析出或反应体系浑浊，从而影响后续偶联反应的推进。

         在后处理和放大阶段，标签的价值主要体现在中间体处理方式的改变。传统 LPPS 往往需要在每一步反应后分离和纯化中间体，而 TAG-LPPS 有机会将部分中间体处理转化为沉淀、过滤、洗涤或相分离操作，从而降低中间体纯化负担。

         TAG-LPPS 并不意味着最终产物不需要纯化。对于药物多肽或高纯度科研试剂，最终仍需要通过合适的精制方法控制纯度、杂质谱和残留。

5. 哪些多肽项目适合考虑 TAG-LPPS

         TAG-LPPS适合作为难溶、难分离或需要放大制备项目中的路线评估选择。适合考虑 TAG-LPPS 的多肽项目类型如下表。

         TAG-LPPS 是路线选择之一，并不是所有难溶、难分离或需要放大的多肽项目都一定适用。是否值得采用，关键要看当前路线的主要瓶颈是什么：如果问题主要来自中间体难溶、反应后难分离，或放大时纯化压力过大，而标签能够改善这些问题，TAG-LPPS 才具有评价价值。

         对于在 SPPS 中容易出现缺失肽杂质的序列，可以考虑将 TAG-LPPS 作为替代路线进行评估。SPPS 中若某一步偶联不完全，未完全延伸的链段可能继续参与后续反应，最终形成与目标肽性质接近的缺失肽杂质。TAG-LPPS 的潜在价值在于，液相体系中的带标签中间体通常更便于 HPLC、LC-MS 等中控检测，也更有机会通过中间体分离和过程控制及早发现问题。

         TAG-LPPS 并不意味着一定能消除缺失肽杂质。最终是否适合采用，仍需结合标签连接是否稳定、偶联效率是否提高、中间体分离是否有效，以及标签脱除是否顺利等因素进行验证。

6. 如何设计标签辅助液相肽合成路线

         TAG-LPPS 的设计重点是判断标签是否真正解决当前路线中的关键问题。

6.1 分析肽序列特征

路线设计前应先分析序列中可能影响合成的因素：

         ①疏水残基比例；

         ②连续疏水片段；

         ③易聚集序列；

         ④空间位阻较大的氨基酸；

         ⑤易消旋残基；

         ⑥含硫、含吲哚或其他敏感结构；

         ⑦是否需要环化、二硫键形成或 C 端酰胺化。

         这些因素会影响标签类型、连接方式和脱除条件。

6.2 判断主要问题来自反应还是分离

         1. 如果主要问题是偶联效率低，应优先评估标签是否能改善溶解性和反应浓度。

         2. 如果主要问题是中间体难分离，应重点考察沉淀、过滤、洗涤或相分离效果。

         3. 如果主要问题是放大困难，应重点评估溶剂安全性、固体形态、过滤速度和杂质去除能力。

6.3 确定标签连接位置

         多数 TAG-LPPS 路线会从肽链 C 端进行设计，使肽链按照 C 端到 N 端方向延伸。若目标肽需要 C 端酰胺化、特殊侧链修饰或后续环化，应提前确认标签连接方式、脱除方式和后续转化步骤是否会影响最终结构。

6.4 评价沉淀和洗涤效果

标签是否有效，不能只看反应转化率，还要看后处理表现。需要重点确认：

         ①加入不良溶剂后是否形成可过滤固体；

         ②沉淀是否夹带较多杂质；

         ③洗涤是否导致目标中间体损失；

         ④滤饼是否黏稠或堵滤；

         ⑤放大后颗粒形态是否稳定。

         如果沉淀回收率低，或者过滤操作困难，标签策略未必适合该路线。

6.5 验证最终脱除条件

标签脱除是 TAG-LPPS 成败的关键步骤之一。脱除条件应尽量温和，并与肽链中的敏感结构兼容。需要确认：

         ①标签是否脱除完全；

         ②脱除过程中是否发生肽链降解；

         ③是否产生难除副产物；

         ④脱除后粗品是否适合后续精制；

         ⑤目标多肽结构是否保持完整。

         只有连接、延伸、分离和脱除都能顺利完成，TAG-LPPS 才能成为可用路线。

7. 使用 TAG-LPPS 时需要注意的问题

7.1 标签结构不能只追求疏水性

         疏水性增强有助于沉淀或相分离，但过强的疏水性也可能带来新的问题，例如反应溶剂选择受限、固体过滤困难、洗涤损失增加或残留杂质难去除。标签结构需要在溶解性、分离能力和脱除便利性之间取得平衡。

7.2 沉淀不等于纯化完成

         沉淀只是分离手段。真正有效的中间体处理，需要同时满足较高回收率和较好的杂质去除效果。如果目标中间体与杂质共同沉淀，后处理并没有真正简化。

7.3 小试结果需要经过放大验证

         小试中容易过滤的沉淀，放大后可能因颗粒细、滤饼黏、搅拌不均或析出速度过快而难以操作。因此，TAG-LPPS 的放大评价应包括过滤性、洗涤效率、干燥性能和批次稳定性。

7.4 标签脱除不能影响目标肽

         部分多肽含有半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等敏感残基。若标签脱除条件过强，可能引发氧化、脱酰胺、消旋或链降解。标签脱除条件必须在路线早期进行验证。

7.5 最终仍需质量控制

         TAG-LPPS 可以降低中间体处理难度，但不能替代最终质量控制。对于药物多肽，仍需关注最终纯度、有关物质、残留溶剂、残留试剂、盐型和水分等质量指标。

8. 标签辅助液相肽合成相关代表化学品分类表

表1. 标签与载体构建相关产品

表2. 保护基引入、脱保护与裂解相关产品

表3. 缩合剂、缩合添加剂、有机碱与催化剂

         注：HOBt、HOAt 等苯并三氮唑类缩合添加剂在储存、运输和放大使用时需关注热稳定性和安全风险；工艺放大研究中应结合 SDS、法规要求和工艺安全评估选择合适缩合体系。

表4. 反应溶剂、沉淀溶剂与洗涤溶剂

        注：DMF、DCM 等传统溶剂在多肽合成中应用广泛，但放大研究时应综合评估毒理、法规、溶剂回收、废液处理和替代溶剂可行性。

表5. Fmoc保护氨基酸与侧链保护氨基酸单体

         注：以上为阿拉丁代表产品，更多产品规格可用‘品名/CAS/货号’在阿拉丁官网检索。

参考文献

[1] Sharma A., Kumar A., de la Torre B. G., Albericio F. Liquid-Phase Peptide Synthesis (LPPS): A Third Wave for the Preparation of Peptides. Chemical Reviews, 2022, 122(16): 13516-13546.

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[3] Yano S., Mori T., Kubota H. Silylated Tag-Assisted Peptide Synthesis: Continuous One-Pot Elongation for the Production of Difficult Peptides under Environmentally Friendly Conditions. Molecules, 2021, 26(12): 3497.

[4] Isidro-Llobet A., Kenworthy M. N., Mukherjee S., Kopach M. E., Wegner K., Gallou F., Smith A. G., Roschangar F. Sustainability Challenges in Peptide Synthesis and Purification: From R&D to Production. The Journal of Organic Chemistry, 2019, 84(8): 4615-4628.

[5] Ferrazzano L., Catani M., Cavazzini A., Martelli G., Corbisiero D., Cantelmi P., Fantoni T., Mattellone A., De Luca C., Felletti S., Cabri W., Tolomelli A. Sustainability in Peptide Chemistry: Current Synthesis and Purification Technologies and Future Challenges. Green Chemistry, 2022, 24: 975-1020.

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