番红O-固绿染色是软骨组织学评价中常用的经典染色方法，主要用于显示软骨基质中蛋白聚糖和糖胺聚糖的保留、缺失及分布变化。该方法通过番红O对酸性基质成分的阳离子染色，以及固绿对胶原、细胞质和背景组织的复染，使软骨基质退变、表层磨损、裂隙形成和软骨下骨改变更加直观。

        关键词：番红O；固绿；软骨组织学；蛋白聚糖；糖胺聚糖；硫酸软骨素；骨关节炎；OARSI评分；Mankin评分

1软骨组织学评价的基本目标

1.1软骨基质完整性

（1）细胞外基质保留

        关节软骨由少量软骨细胞和大量细胞外基质构成。Ⅱ型胶原网络决定软骨的抗张强度，蛋白聚糖和糖胺聚糖决定软骨的吸水性、抗压能力和弹性缓冲性能。软骨退变早期常表现为蛋白聚糖流失，而明显的胶原网络破坏、软骨裂隙和软骨厚度下降通常出现在更进一步的退变阶段。

（2）蛋白聚糖显示

        番红O-固绿染色的核心价值在于显示软骨基质中酸性蛋白聚糖的分布。正常软骨基质通常呈橙红色至红色；若发生退变、酶解或机械损伤，番红O染色强度会减弱，严重区域可出现局部或广泛染色缺失。

（3）层区变化观察

        软骨不同层区的蛋白聚糖含量、细胞形态和胶原排列存在差异。番红O染色可辅助观察表层、中层、深层和钙化软骨层的基质变化，尤其适合判断退变是否从表层向深层扩展。

1.2软骨退变程度

        在骨关节炎、创伤性软骨损伤、软骨缺损修复、药物干预和组织工程软骨评价中，单纯观察软骨厚度不足以反映基质质量。番红O-固绿染色可同时呈现软骨表面完整性、基质染色强度、细胞排列、裂隙深度和软骨下骨结构，是组织学评分的重要依据。

1.3修复组织质量

        软骨修复实验中，修复组织可能表现为透明软骨、纤维软骨或混合型组织。透明软骨样组织通常具有较强番红O阳性染色，并与周围正常软骨衔接较好；纤维软骨则常表现为固绿染色增强、番红O染色较弱，提示胶原性纤维组织较多而蛋白聚糖沉积不足。

2番红O-固绿染色的染色原理

2.1番红O对酸性基质的识别

（1）阳离子染料特征

        番红O是一种阳离子碱性染料，可与软骨基质中带负电荷的酸性糖胺聚糖结合。软骨蛋白聚糖中含有大量硫酸软骨素、硫酸角质素等酸性基团，因此可被番红O明显染成红色或橙红色。

（2）蛋白聚糖含量指示

        番红O染色强度通常与软骨基质中蛋白聚糖和糖胺聚糖含量相关。染色越强，通常提示酸性蛋白聚糖保留越好；染色减弱则常提示基质退变、蛋白聚糖流失或修复组织质量不足。

（3）空间分布显示

        正常关节软骨不同层区的蛋白聚糖含量并不完全一致，因此番红O染色也可显示层区差异。退变组织中，表层软骨往往最早出现染色减弱，随后可向中层、深层逐渐扩展。

2.2固绿的背景复染作用

（1）胶原和非软骨组织复染

        固绿是一种酸性染料，可对胶原纤维、细胞质和部分背景组织形成绿色染色。在番红O-固绿染色体系中，固绿主要用于提供组织结构背景，使软骨、骨组织、纤维组织和细胞形态更易区分。

（2）红绿对比关系

        番红O显示富含蛋白聚糖的软骨基质，固绿显示胶原性组织和背景结构。二者形成红绿对比，有利于判断软骨基质是否保留、修复组织是否偏纤维化，以及软骨下骨和周围结缔组织结构。

（3）分化控制

        固绿复染过强可能遮盖番红O的红色信号，尤其在轻度退变或弱阳性样本中更容易影响判读。因此，固绿染色时间和分化步骤需要严格控制。

2.3苏木精核染辅助

        番红O-固绿染色通常会加入苏木精核染步骤，用于显示软骨细胞核和骨组织细胞核。核染可辅助观察软骨细胞数量、细胞簇集、排列异常、细胞空泡样改变和软骨下骨细胞结构。核染过深会影响细胞周围基质观察，核染不足则不利于判断软骨细胞形态，因此需要与番红O和固绿染色强度相协调。

3染色流程与关键步骤

3.1样本固定

（1）固定液选择

        软骨组织通常使用中性福尔马林或多聚甲醛固定。固定的目标是保存组织结构、细胞形态和基质成分，避免脱钙、脱水和包埋过程中出现结构塌陷。

（2）固定时间

        固定不足会导致组织结构保存不良，切片易碎或脱片；固定过度则可能影响后续染色均一性。小动物关节样本和大动物软骨样本的固定时间应根据组织体积、骨组织比例和脱钙方案调整。

（3）基质流失控制

        软骨基质中的糖胺聚糖具有一定水溶性和扩散风险。固定和后处理过程应避免过度浸泡、强酸长时间处理和剧烈机械操作，以减少基质成分丢失。

3.2脱钙处理

（1）脱钙必要性

        含软骨下骨的关节样本通常需要脱钙后才能石蜡包埋和切片。脱钙质量直接影响软骨表面完整性、软骨下骨形态和染色结果。

（2）酸性脱钙与螯合脱钙

        强酸脱钙速度快，但可能损伤软骨基质并降低番红O染色强度；EDTA脱钙相对温和，更有利于保存软骨基质和细胞形态。用于软骨退变评分和定量分析时，EDTA脱钙通常更适合。

（3）脱钙终点控制

        脱钙不足会导致切片破损或刀痕明显；脱钙过度会造成组织松散、基质染色减弱和细胞结构模糊。实验中应根据样本大小建立稳定的脱钙时间和终点判断标准。

3.3切片与贴片

（1）切片厚度

        软骨组织学评价中常用4–6 μm石蜡切片。切片过厚会导致染色偏深、层次不清；切片过薄则可能使软骨基质信号偏弱，影响番红O强度判断。

（2）切面选择

        关节软骨评价需保证切面一致。例如小鼠膝关节常要求经过股骨髁、胫骨平台和半月板相对标准的位置。切面偏差会影响软骨厚度、损伤面积和评分结果。

（3）防脱片处理

        骨软骨组织脱钙后仍可能较硬，染色步骤多且包含多次水洗和分化，容易发生脱片。建议使用防脱载玻片，并保证烤片充分。

3.4染色步骤

（1）脱蜡复水

        石蜡切片需经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后进入水相染色体系。脱蜡不彻底会导致染色不均或局部拒染。

（2）核染

        先使用苏木精进行细胞核染色，随后进行分化和返蓝，使细胞核结构清晰。核染时间应根据切片厚度和组织类型优化。

（3）固绿复染

        固绿用于染胶原性背景和非软骨组织。该步骤时间不宜过长，否则可能影响后续番红O着色显示。

（4）酸性分化

        部分流程使用弱酸快速分化，去除多余固绿。分化不足会导致背景偏深，分化过度则可能影响整体组织对比。

（5）番红O染色

        番红O染色用于显示软骨基质中蛋白聚糖。染色后应快速脱水、透明和封片，避免红色信号被过度洗脱。

4染色结果判读

4.1正常软骨表现

        正常关节软骨表面连续、层次清楚，软骨基质番红O染色较均匀，呈橙红色至红色。软骨细胞分布有一定层区特征，浅层细胞较扁平，中深层细胞较圆，深层接近潮线区域。固绿主要显示软骨下骨、纤维组织和背景结构。

4.2退变软骨表现

（1）番红O染色减弱

        早期退变常见表层或局灶区域番红O染色变浅，提示蛋白聚糖丢失。随着退变加重，染色减弱可向深层扩展。

（2）表面结构破坏

        软骨表面可出现粗糙、裂隙、纤维化、剥脱或缺损。裂隙深度是骨关节炎组织学评分中的重要指标。

（3）软骨细胞异常

        软骨退变中可出现细胞簇集、细胞减少、细胞肥大样改变或空泡样改变。番红O-固绿染色可辅助观察这些变化，但若需明确细胞死亡或肥大分化，还需结合免疫组化或分子检测。

（4）软骨下骨改变

        软骨下骨板增厚、骨赘形成和骨髓腔结构变化常与软骨退变并存。固绿复染有助于观察这些背景结构。

4.3修复组织表现

（1）透明软骨样修复

        若修复区番红O染色较强、细胞呈软骨样圆形分布，并与周围软骨整合较好，通常提示修复组织具有较好的软骨基质特征。

（2）纤维软骨样修复

        若修复区固绿染色明显、番红O染色较弱，且细胞呈梭形或纤维样排列，提示修复组织偏纤维化，蛋白聚糖沉积不足。

（3）混合型修复

        实际组织工程或软骨缺损修复中常见混合型修复组织，即局部番红O阳性、局部固绿阳性增强。此时应结合Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原、Aggrecan等指标进一步判断修复质量。

5在骨关节炎研究中的应用

5.1退变分级

        番红O-固绿染色是骨关节炎动物模型中常用的组织学评价方法。通过观察软骨表面完整性、番红O染色强度、裂隙深度、软骨厚度和软骨下骨变化，可对退变程度进行分级。

5.2OARSI评分

        OARSI评分体系常用于骨关节炎组织学评价，强调软骨损伤深度和损伤范围。番红O染色可显示蛋白聚糖丢失区域，固绿可显示纤维化和骨组织背景，因此适合支持OARSI评分判读。

5.3Mankin评分

        Mankin评分通常包括结构、细胞、基质染色和潮线完整性等项目。番红O染色强度是其中评价基质蛋白聚糖丢失的重要依据。染色条件不稳定会直接影响评分结果，因此同一批评分样本应尽量统一染色流程。

5.4药物干预评价

        在抗炎、抗退变、促软骨修复或抑制基质降解的药物研究中，番红O-固绿染色可用于判断药物是否维持软骨蛋白聚糖含量、减少表层破坏或改善软骨下骨改变。若染色结果显示番红O信号增强，应结合生化GAG检测、Aggrecan免疫染色或qPCR进一步验证。

6在软骨修复与组织工程中的应用

6.1支架材料评价

        组织工程软骨支架常需评价细胞是否在材料中形成富含蛋白聚糖的软骨样基质。番红O阳性增强提示糖胺聚糖沉积增加，但若材料本身带有电荷或具有染料吸附能力，需要设置材料空白对照。

6.2干细胞成软骨诱导

        间充质干细胞成软骨诱导后，可通过番红O-固绿染色观察软骨样基质形成。细胞团、微团培养或三维水凝胶体系中，番红O阳性区域通常提示蛋白聚糖沉积。若固绿染色较强而番红O较弱，可能提示纤维化基质或成软骨诱导不足。

6.3软骨缺损修复模型

        在全层软骨缺损、骨软骨缺损和微骨折修复模型中，该染色可显示修复区与原生软骨的边界、修复组织基质性质、表面平整度和软骨下骨重建情况。对于评价修复质量，番红O-固绿染色通常应与宏观评分、免疫组化和力学检测结合使用。

7定量分析与评分策略

7.1半定量评分

        番红O-固绿染色最常见的应用是组织学评分。评分前应明确标准，包括软骨表面是否完整、裂隙是否进入中层或深层、番红O染色是否减弱、软骨细胞是否簇集、潮线是否破坏以及软骨下骨是否异常。

7.2图像定量

（1）染色面积分析

        可通过图像分析软件测量番红O阳性面积、阳性面积占软骨总面积比例或平均光密度。该方法适合比较不同处理组的蛋白聚糖保留水平。

（2）颜色分离

        由于番红O和固绿存在颜色重叠，图像定量时可使用颜色分离或阈值法提取红色信号。阈值设置应统一，并在所有图像中保持一致。

（3）区域分层分析

        软骨退变具有层区特征，可分别分析表层、中层和深层番红O强度。分层分析比整体平均值更能反映早期退变。

7.3定量限制

        番红O染色强度受固定、脱钙、切片厚度、染色时间和脱水速度影响明显。因此，它适合作为组织学半定量或相对比较方法，不宜单独作为糖胺聚糖绝对定量依据。若需要准确测定GAG含量，应结合DMMB法、生化定量或糖胺聚糖二糖组成分析。

8技术影响因素与质量控制

8.1脱钙对染色的影响

        脱钙是影响软骨番红O染色结果的关键前处理步骤。强酸脱钙可能导致糖胺聚糖流失，使番红O染色减弱；EDTA脱钙相对温和，更适合保留软骨基质。不同脱钙方法处理的样本不宜直接比较染色强度。

8.2染色时间控制

        番红O染色不足会导致软骨基质信号偏弱，染色过度则可能增加背景。固绿染色过强会掩盖弱阳性的番红O信号。实验中应使用统一染色时间、统一试剂批次和统一脱水流程。

8.3快速脱水

        番红O染色后通常需要快速通过梯度乙醇脱水。若在乙醇中停留过久，红色信号可能被洗脱，导致染色偏浅。操作中应保持各切片脱水时间一致。

8.4阳性与阴性对照

（1）阳性对照

        可选择正常关节软骨或已知富含蛋白聚糖的软骨组织作为阳性对照，确认番红O染色体系有效。

（2）阴性或弱阳性对照

        退变软骨、酶解处理软骨或蛋白聚糖丢失明显的组织可作为弱阳性对照，帮助判断染色灵敏度。

（3）批内一致性

        组织学评分样本应尽量同批染色。若必须分批染色，应设置共同对照切片，用于校正批间差异。

9与其他软骨评价方法的联合应用

9.1免疫组织化学

        番红O-固绿染色可显示总体蛋白聚糖保留，但不能区分具体基质分子。若需要确认软骨表型，可联合Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9免疫组化；若需要判断纤维化或异常修复，可检测Ⅰ型胶原；若关注肥大分化，可检测Ⅹ型胶原和MMP13。

9.2生化检测

        DMMB法可用于检测硫酸化糖胺聚糖含量，与番红O染色具有一定互补性。硫酸软骨素标准品、二糖标准品和软骨素酶消化体系可进一步用于分析GAG组成、硫酸化模式和基质降解程度。羟脯氨酸检测可反映胶原总量，钙含量检测可用于判断软骨钙化或骨化趋势。

9.3分子检测

        RT-qPCR或转录组分析可检测Col2a1、Acan、Sox9、Col1a1、Col10a1、Mmp13、Adamts5等基因表达。组织学染色反映结构结果，分子检测则有助于解释基质合成和降解机制。

9.4影像与力学检测

        Micro-CT可用于观察软骨下骨和骨赘变化，但对未矿化软骨显示有限。力学测试可评价软骨抗压和弹性性能。软骨修复研究中，番红O-固绿染色与力学性能结合更能反映修复组织质量。

10软骨组织学评价相关试剂与材料选型

10.1番红O-固绿染色、GAG验证与软骨基质评价相关产品

        番红O-固绿染色适合从组织结构层面评价软骨蛋白聚糖保留、基质退变和修复组织性质。实际应用中，应重视固定、脱钙、切片、染色时间和图像分析的一致性，并结合GAG组成分析、Ⅱ型胶原、Aggrecan、Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原和MMP13等指标共同判断软骨退变或修复质量。

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[1] 透明软骨形态学观察实验