微生物可通过乙酸生成途径快速释放过量碳并获得ATP，也可将外源乙酸活化为乙酰辅酶A。磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶和乙酰辅酶A合成酶共同调控乙酸生成、再利用及中心碳代谢分配。

        关键词：乙酸代谢；磷酸乙酰转移酶；乙酸激酶；乙酰辅酶A合成酶；乙酰磷酸；乙酰辅酶A；底物水平磷酸化；溢流代谢；微生物发酵；代谢工程

1 微生物乙酸代谢的主要途径与生理意义

1.1 乙酸生成途径

        微生物中的乙酸主要来源于乙酰辅酶A、乙酰磷酸或乙醛。糖酵解产生的丙酮酸可经丙酮酸脱氢酶转化为乙酰辅酶A；在部分厌氧微生物中，丙酮酸甲酸裂解酶也可生成乙酰辅酶A。乙酰辅酶A随后经磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶连续催化，形成乙酸并伴随ATP生成。部分微生物还可通过丙酮酸氧化酶将丙酮酸转化为乙酰磷酸，再由乙酸激酶生成乙酸；乙酸菌及部分酵母和细菌则可通过醇脱氢酶和乙醛脱氢酶依次氧化乙醇和乙醛，最终形成乙酸。

1.2 乙酸利用途径

        外源乙酸必须先转化为乙酰辅酶A，才能进入三羧酸循环、乙醛酸循环、脂肪酸合成及其他乙酰辅酶A依赖途径。乙酰辅酶A合成酶是低浓度乙酸利用的主要酶，可直接催化乙酸、辅酶A和ATP生成乙酰辅酶A。部分微生物在乙酸浓度较高时，也可利用乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶的逆向反应，先将乙酸转化为乙酰磷酸，再生成乙酰辅酶A。

图1 乙酸活化及其进入三羧酸循环的示意图

1.3 乙酸代谢的生理意义

（1）能量生成

        乙酰辅酶A经磷酸乙酰转移酶–乙酸激酶途径转化为乙酸时，可通过底物水平磷酸化生成ATP。该途径在厌氧、氧受限或呼吸能力不足时具有重要供能作用。

（2）碳流分配

        当糖酵解形成乙酰辅酶A的速度超过三羧酸循环和呼吸链的处理能力时，过量碳可通过乙酸形式排出。碳源耗尽后，部分微生物又可重新摄取乙酸，使乙酸成为连接碳溢出与碳回收的动态代谢节点。

（3）辅酶A再生

        磷酸乙酰转移酶将乙酰辅酶A转化为乙酰磷酸时释放游离辅酶A，有助于维持丙酮酸氧化、脂肪酸分解及其他辅酶A依赖反应。

（4）环境适应

        乙酸积累可降低培养液pH。未解离乙酸可穿过细胞膜并在胞内解离，增加质子排出和离子稳态维持所需的能量，从而抑制微生物生长和目标产物合成。

1.4 不同微生物中的途径差异

        多数细菌含有磷酸乙酰转移酶–乙酸激酶途径和乙酰辅酶A合成酶途径，但两条途径的表达水平和生理功能因菌种而异。酵母和丝状真菌通常依赖乙酰辅酶A合成酶完成乙酸同化，并通过乙醛脱氢酶参与乙酸形成。部分古菌和严格厌氧微生物含有ADP形成型乙酰辅酶A合成酶，可直接催化乙酰辅酶A、ADP和无机磷酸生成乙酸、ATP和辅酶A，该酶与常见的AMP形成型乙酰辅酶A合成酶在反应方向和能量偶联方式上不同。

2 乙酸生成与利用相关酶的分类及反应特征

2.1 乙酸生成相关酶

        磷酸乙酰转移酶负责乙酰辅酶A与乙酰磷酸之间的可逆乙酰基转移，乙酸激酶则催化乙酰磷酸和ADP生成乙酸与ATP，两种酶连续作用构成细菌乙酸生成和底物水平磷酸化的重要途径。乙醛脱氢酶可将乙醛氧化为乙酸，同时生成NADH或NADPH；丙酮酸氧化酶则可将丙酮酸转化为乙酰磷酸，为乙酸激酶提供直接底物。

2.2 乙酸利用相关酶

        乙酰辅酶A合成酶催化乙酸、辅酶A和ATP生成乙酰辅酶A、AMP和焦磷酸，该反应经过乙酰腺苷酸中间体，通常具有较高的乙酸亲和力。在部分细菌中，乙酸激酶–磷酸乙酰转移酶途径还可逆向运行，其乙酸亲和力通常低于乙酰辅酶A合成酶，但在乙酸浓度较高时可提供较大的乙酸活化通量。

2.3 乙酰辅酶A后续利用相关酶

        乙酰辅酶A进入三羧酸循环时，首先由柠檬酸合酶与草酰乙酸缩合生成柠檬酸。以乙酸为主要碳源时，异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶构成的乙醛酸循环可减少碳以CO₂形式损失，使乙酸碳用于糖异生和生物量合成。乙酰辅酶A还可进入脂肪酸、聚羟基脂肪酸酯、异戊二烯类及其他次级代谢产物合成途径，因此乙酸活化效率会直接影响乙酰辅酶A衍生产品的合成能力。

2.4 关键酶的功能比较

表1 微生物乙酸代谢关键酶的反应特征

3 磷酸乙酰转移酶–乙酸激酶途径的代谢功能

3.1 磷酸乙酰转移酶介导的乙酰基转移

        磷酸乙酰转移酶（phosphotransacetylase，PTA）催化“乙酰辅酶A＋Pi⇌乙酰磷酸＋CoA”的可逆反应，将乙酰辅酶A中的高能硫酯键转化为乙酰磷酸中的高能酰基磷酸键，同时释放游离辅酶A。生成的乙酰磷酸既可作为乙酸激酶的底物，也可参与双组分调控系统、蛋白乙酰化及其他代谢调控过程。

3.2 乙酸激酶介导的底物水平磷酸化

        乙酸激酶（acetate kinase，ACK）催化“乙酰磷酸＋ADP⇌乙酸＋ATP”的可逆反应。正向反应将乙酰磷酸中的磷酸基转移至ADP，形成ATP和乙酸，不依赖电子传递链，可在发酵代谢或呼吸能力不足时提供额外ATP；逆向反应则消耗ATP，将乙酸转化为乙酰磷酸，并可继续经PTA生成乙酰辅酶A，但这一方向通常需要较高的乙酸浓度。

3.3 乙酸溢流代谢

        当葡萄糖摄取速度超过三羧酸循环、呼吸链及生物合成途径的处理能力时，过量乙酰辅酶A会进入PTA–ACK途径。该过程可快速再生辅酶A并获得ATP，但会造成乙酸排出。乙酸溢流不仅发生于缺氧条件，高糖浓度、呼吸容量受限、蛋白质资源分配改变及胞内代谢物比例变化均可能促进乙酸生成。

3.4 乙酰磷酸的调控作用

        乙酰磷酸不仅是乙酸代谢中间体，还可向部分双组分调控系统的响应调节蛋白提供磷酸基，其水平变化可能影响趋化、运动性、应激反应、生物膜形成和毒力相关基因表达。乙酰磷酸还可参与蛋白质赖氨酸的非酶促乙酰化，因此PTA或ACK活性变化可能进一步影响代谢酶和转录调控蛋白的乙酰化状态。

3.5 途径方向与代谢物浓度

        PTA–ACK途径的净反应方向受乙酰辅酶A、乙酰磷酸、乙酸、ATP、ADP、辅酶A和无机磷酸浓度共同影响。高糖和高乙酰辅酶A条件通常促进乙酸生成，而外源乙酸浓度较高且其他碳源不足时，逆向乙酸利用可能增强。仅检测pta或ackA基因表达不能准确判断途径方向，需要结合酶活性、胞外乙酸浓度和胞内代谢物变化进行分析。

4 乙酰辅酶A合成酶介导的乙酸活化机制

4.1 乙酸腺苷化

        乙酰辅酶A合成酶（acetyl-CoA synthetase，ACS）首先催化“乙酸＋ATP→乙酰-AMP＋PPi”的反应，形成酶结合的乙酰腺苷酸中间体。乙酸羧基被腺苷化后，乙酰基反应活性提高，为后续辅酶A亲核攻击和乙酰基转移创造条件。

4.2 乙酰基向辅酶A转移

        辅酶A随后攻击乙酰腺苷酸中间体，完成“乙酰-AMP＋CoA→乙酰辅酶A＋AMP”的反应。生成的焦磷酸可进一步水解为无机磷酸，使总反应趋向乙酰辅酶A生成。由于ATP被转化为AMP，该过程相当于消耗两个高能磷酸键当量。

4.3 高亲和力乙酸摄取

        ACS通常具有较高的乙酸亲和力，适合低浓度乙酸的摄取和清除。分批培养中，当葡萄糖等主要碳源耗尽后，部分微生物可提高ACS表达，重新利用培养早期排出的乙酸。生成的乙酰辅酶A可进入三羧酸循环和乙醛酸循环，支持细胞继续生长，因此乙酸由积累转为消耗通常提示培养过程进入后期碳源转换阶段。

4.4 ACS的转录调控

        ACS表达常受碳源状态、生长阶段和全局碳代谢调控网络控制。易利用碳源充足时，ACS表达可能受到碳分解代谢阻遏；主要碳源耗尽或乙酸成为主要碳源后，ACS表达通常上升。不同微生物的转录调控因子和启动子结构并不相同，因此评价ACS调控时应结合具体菌种、培养条件和生长阶段进行分析。

4.5 ACS的可逆乙酰化调控

        部分细菌可通过关键赖氨酸残基的可逆乙酰化调节ACS活性。乙酰转移酶催化的乙酰化通常抑制ACS，而依赖NAD⁺的去乙酰化酶可恢复其催化活性。这种翻译后调控能够在不改变蛋白表达量的情况下快速调节乙酸活化通量，因此检测ACS总蛋白时应同步评价酶活性或乙酰化状态，避免将蛋白表达量直接等同于实际催化能力。

5 不同乙酸代谢途径的能量收益与调控差异

5.1 PTA–ACK正向途径的能量收益

        乙酰辅酶A经PTA–ACK途径生成乙酸时，每生成一分子乙酸可形成一分子ATP，该ATP来自底物水平磷酸化，不直接依赖氧化磷酸化。该途径能够快速回收部分能量，但在乙酸排出阶段，乙酰辅酶A中的碳不能继续通过三羧酸循环产生更多还原当量和ATP；若乙酸随后被重新摄取并活化为乙酰辅酶A，则仍可重新进入中心碳代谢，因此其优势是反应速度快，代价是碳利用效率下降。

5.2 ACS途径的能量成本

        ACS将ATP转化为AMP和焦磷酸，相当于消耗两个高能磷酸键当量。该途径能量成本较高，但对低浓度乙酸具有较强捕获能力，适合在乙酸浓度较低或细胞需要回收胞外乙酸时发挥作用。其实际通量还受ATP供应、辅酶A水平和下游乙酰辅酶A消耗速度限制。

5.3 PTA–ACK逆向途径的能量成本

        PTA–ACK逆向途径将乙酸转化为乙酰辅酶A时，乙酸激酶消耗ATP并生成ADP。与ACS相比，该途径的高能磷酸键消耗较少，但乙酸亲和力通常较低，因此更适合较高乙酸浓度条件；低乙酸条件下，ACS通常是更有效的乙酸摄取途径。

5.4 生长阶段与途径切换

        高糖生长阶段常以乙酸生成为主，PTA和ACK参与过量碳排出及ATP形成。当主要碳源逐渐耗尽后，乙酸生成通量下降，ACS及乙醛酸循环相关酶表达增加，细胞开始消耗已积累的乙酸。乙酸浓度的时间变化比单一终点浓度更有判读价值，连续积累、平台期和后期下降分别提示乙酸持续生成、生成与利用平衡以及乙酸再利用增强。

5.5 能量与调控差异比较

表2 不同乙酸代谢途径的功能差异

6 乙酸代谢关键酶在发酵、碳代谢与代谢工程中的应用

6.1 高密度培养与重组蛋白生产

        高密度细菌培养中，碳源过量常引起乙酸积累。乙酸可抑制细胞生长、降低重组蛋白表达并增加细胞维持能耗，因此控制碳源摄取与PTA–ACK通量是发酵优化的重要内容。降低补料速率、提高供氧能力、增强呼吸代谢或采用较少产生乙酸的宿主，可减少乙酸积累；直接敲除pta或ackA虽然可能降低乙酸生成，但也可能影响ATP供应、辅酶A再生和乙酰磷酸调控。

6.2 乙酸及有机酸发酵

        以乙酸为目标产物时，可增强乙酰辅酶A向乙酸生成途径的分配，并降低乙酸再利用，同时提高菌株的酸耐受性和乙酸外排能力。以乙醇为底物的乙酸发酵主要依赖醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，该途径与PTA–ACK途径在碳源、电子传递和能量形成方式方面不同，应根据生产菌种分别设计调控策略。

6.3 乙酸作为替代碳源

        乙酸可来源于厌氧消化、合成气发酵、生物质热解液及其他工业过程。通过增强ACS、乙醛酸循环和乙酰辅酶A下游途径，可将乙酸转化为脂肪酸、聚羟基脂肪酸酯、萜类和其他生物基产品。乙酸同化会消耗ATP并增加酸胁迫，因此不能只提高乙酸摄取，还需要同步优化ATP供应、质子排出、辅酶A再生和目标产物合成通量。

6.4 降低乙酸副产物形成

        在氨基酸、核苷酸、酶制剂及重组蛋白生产中，乙酸通常属于不利副产物。可通过降低葡萄糖摄取速率、增强三羧酸循环、提高呼吸能力或优化乙酰辅酶A分配减少乙酸形成。乙酸浓度下降并不一定代表碳利用得到改善，若菌体生长和目标产物同步下降，则可能只是总体碳代谢减弱，需要结合碳收率和产物得率判断改造效果。

6.5 提高乙酰辅酶A衍生物合成

        增强ACS表达可将外源乙酸直接导入乙酰辅酶A代谢池，使用高活性或不易被乙酰化失活的ACS有助于提高低浓度乙酸的转化能力。提高乙酸活化后，还需增强目标产物合成途径并减少无效循环，否则过量乙酰辅酶A可能重新进入乙酸生成途径，或因ATP消耗增加而限制细胞生长。

6.6 稳定同位素代谢示踪

        ¹³C标记乙酸可用于追踪乙酸碳进入乙酰辅酶A、三羧酸循环、脂质及目标产物的过程。结合质谱检测同位素分布，可评价乙酸摄取速度及不同乙酸活化途径的贡献。示踪实验需要考虑未标记碳源稀释、代谢池交换和培养阶段变化，并同步测定胞外乙酸、胞内乙酰辅酶A及下游代谢物的标记比例。

7 乙酸代谢酶活性检测与代谢产物评价

7.1 磷酸乙酰转移酶活性检测

        PTA活性可通过检测乙酰辅酶A消耗、辅酶A生成或乙酰磷酸形成进行评价。辅酶A可采用巯基反应显色法测定，乙酰辅酶A和乙酰磷酸则可采用酶偶联或色谱方法检测。由于PTA反应可逆，检测时必须明确反应方向，不同样品比较时还应统一底物浓度、pH、温度、反应时间和蛋白定量方法。

7.2 乙酸激酶活性检测

        ACK活性可通过检测正向反应中的ATP或乙酸生成，也可检测逆向反应中的ADP或乙酰磷酸形成。ATP和ADP通常采用发光法、比色法或酶偶联法测定。粗酶液中的ATP酶、磷酸酶及其他激酶可能干扰结果，因此实验应设置无酶、无底物和热灭活对照，并在初始线性反应阶段测定酶活。

7.3 乙酰辅酶A合成酶活性检测

        ACS活性可通过检测乙酰辅酶A、AMP、焦磷酸或辅酶A消耗进行评价。酶偶联法适合连续动力学检测，液相色谱和质谱则可直接确认反应产物。ACS属于多底物酶，动力学分析应分别改变乙酸、ATP和辅酶A浓度，仅使用单一底物浓度不能完整评价其底物亲和力和催化效率。

7.4 乙酸含量检测

        培养液中的乙酸可使用酶法试剂盒、高效液相色谱、离子色谱或气相色谱检测。酶法适合常规批量测定，色谱法可同时区分乙酸、甲酸、乳酸、琥珀酸及其他有机酸。样品检测前应通过离心或过滤去除细胞，并记录稀释倍数和采样时间；深色、高糖或高盐发酵液可能干扰比色反应，需要设置基质空白和加标回收对照。

7.5 乙酰辅酶A与乙酰磷酸检测

        乙酰辅酶A可采用酶偶联法、液相色谱或质谱测定。辅酶A硫酯容易降解，采样后应迅速终止代谢并在低温条件下完成提取。乙酰磷酸化学稳定性较低，容易发生水解或乙酰基转移，检测时应缩短采样与提取间隔，不能仅依据pta或ackA表达量推断乙酰磷酸水平。

7.6 能量状态与碳流评价

        ATP、ADP和AMP含量可用于评价细胞能量状态，NADH/NAD⁺比值可反映乙酸代谢与呼吸及发酵之间的联系。评价乙酸代谢时，还应同步检测碳源消耗、菌体生物量和目标产物形成。终点乙酸浓度下降可能由乙酸生成减少、乙酸再利用增强或细胞生长受抑制引起，因此建立培养过程时间序列有助于区分不同机制。

7.7 常用检测指标比较

表3 乙酸代谢酶活性与代谢产物的常用检测方法

8 乙酸代谢关键酶、反应底物与代谢评价产品

表4 乙酸生成与利用相关酶及酶活检测试剂盒

表5 乙酸代谢反应底物、辅酶与关键中间体产品

表6 乙酰辅酶A下游碳流、能量与氧化还原状态评价产品

        微生物乙酸代谢同时承担ATP生成、乙酰辅酶A分配、辅酶A再生和环境适应功能。PTA–ACK途径适合快速释放过量碳并回收ATP，ACS则负责高亲和力乙酸活化。

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[1] 乙酰基代谢酶网络与体外酶学分析