TSA 酪胺信号放大实用指南：低丰度靶标检测信号弱时，如何选试剂、优化流程、降低背景？
TSA 酪胺信号放大实用指南：低丰度靶标检测信号弱时，如何选试剂、优化流程、降低背景？
1 TSA 酪胺信号放大是什么
TSA（Tyramide Signal Amplification，酪胺信号放大）是一种基于 HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）催化反应的信号放大技术，常用于 IHC（Immunohistochemistry，免疫组织化学）、ICC（Immunocytochemistry，免疫细胞化学）、ISH（In Situ Hybridization，原位杂交）、FISH（Fluorescence In Situ Hybridization，荧光原位杂交）和多重免疫荧光检测。TSA 的核心作用是在靶标邻近区域形成高密度、局部化的荧光或生物素标记沉积，从而增强低丰度靶标的检测信号。
TSA 检测通常包括以下关键步骤：
步骤 | 作用 |
一抗识别靶标 | 决定检测的特异性 |
HRP 标记二抗结合一抗 | 将酶定位到靶标附近 |
加入标记酪胺/酪胺衍生物和 H₂O₂（Hydrogen Peroxide，过氧化氢） | HRP 催化酪胺形成活性中间体 |
标记酪胺在靶标附近沉积 | 形成局部高密度信号 |
洗涤、封片、成像 | 获得荧光或显色检测结果 |
TSA 的信号放大来自 HRP 的酶促催化能力。一个 HRP 分子可催化多个标记酪胺/酪胺衍生物分子在靶标附近沉积，因此比常规二抗荧光标记更适合检测低表达或难检测靶标。
2 什么时候适合使用 TSA
2.1 推荐使用 TSA 的情况
TSA 更适合解决“信号不够”的问题，尤其适用于以下实验场景：
实验问题 | TSA 的价值 |
靶标表达量低 | 放大局部信号，提高可检出性 |
普通 IF（Immunofluorescence，免疫荧光）信号弱 | 提高成像信噪比 |
FFPE（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded，福尔马林固定石蜡包埋）组织抗原性下降 | 增强弱阳性信号 |
多重免疫荧光需要多轮染色 | 酪胺沉积后信号较稳定，便于后续抗体处理 |
多个一抗来自相同宿主 | 可通过逐轮染色、抗体去除或失活，以及残留 HRP 活性终止，降低二抗交叉反应风险 |
样本珍贵 | 有助于在同一张切片上获得更多靶标信息 |
2.2 不建议直接使用 TSA 的情况
TSA 并非所有实验的首选方案。以下情况应谨慎使用：
①靶标本身高丰度，常规二抗检测已能获得清晰信号。
②样本内源性过氧化物酶活性较强，但未进行充分淬灭。
③一抗特异性尚未验证，直接使用 TSA 可能同时放大非特异性背景。
④未完成单标实验验证，直接开展多重染色。
⑤需要进行严格定量分析，但尚未确认信号与靶标量之间的线性关系。
TSA 的优势是提高灵敏度，但它也会放大背景信号。因此，使用 TSA 前应先确认一抗特异性、样本处理条件和对照设置。
3 TSA 试剂怎么选
3.1 按检测方式选择
TSA 试剂选择不应只看荧光颜色，还应同时考虑检测方式、靶标丰度、样本背景、显微镜通道、HRP 检测体系以及是否进行多重染色。TSA 试剂通常可分为荧光标记酪胺和生物素标记酪胺两类。
类型 | 特点 | 适用场景 |
荧光标记酪胺/酪胺衍生物 | 沉积后可直接成像 | 免疫荧光、多重免疫荧光、共定位分析 |
Biotin-Tyramide（生物素标记酪胺/生物素酪胺） | 需结合链霉亲和素体系进一步检测 | 需要二次放大、酶显色或特定检测体系时使用 |
荧光标记酪胺可连接不同荧光基团，如 FITC（Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素）、TAMRA（Tetramethylrhodamine，四甲基罗丹明）、Cy3、Cy5、Alexa Fluor 系列染料等。选择时应根据显微镜光源、滤光片、激光线和检测器配置确定。
3.2 按靶标丰度选择
不同靶标应采用不同强度的检测策略：
靶标丰度 | 建议策略 |
高丰度靶标 | 常规直接或间接免疫荧光通常足够 |
中等丰度靶标 | 可优先使用常规二抗法，必要时轻度放大 |
低丰度靶标 | 适合使用 TSA 酶促放大 |
极低丰度或难检测靶标 | 需优化一抗、HRP 二抗、酪胺浓度和反应时间 |
低丰度靶标可优先安排在亮度高、背景低、光谱干扰少的通道。高丰度靶标不宜过度放大，否则容易出现信号过强、定位模糊或荧光溢出。
3.3 按多重染色组合选择
多重免疫荧光实验中，TSA 试剂选择应同时考虑三点：
①光谱分离：不同荧光信号之间应减少光谱重叠。
②靶标强弱：弱靶标优先使用更亮、更稳定的荧光通道。
③染色顺序：对抗原修复和抗体去除更敏感的靶标，应优先验证染色顺序。
染色顺序不应只按靶标丰度决定，还应结合抗原对多轮热修复、抗体去除或失活步骤的耐受性进行预实验验证。多重实验每一个靶标都应先做单标验证，确认定位、背景和曝光条件后，再进行多重组合。
4 TSA 基础实验流程
4.1 单标 TSA 实验流程
TSA 的基础流程与常规 IHC、ICC 或 IF 接近，但增加了 HRP 催化酪胺沉积步骤。若样本为 FFPE 组织切片，通常还需在抗原修复前完成烤片、脱蜡和复水；细胞、冰冻切片和 FFPE 样本的固定、透化和抗原修复条件应分别优化。
流程 | 目的 |
样本固定和透化 | 保持结构并暴露靶标 |
抗原修复 | 改善 FFPE 组织中抗原可及性 |
内源性过氧化物酶淬灭 | 降低非特异性酶促背景 |
封闭 | 减少非特异性抗体结合 |
一抗孵育 | 识别目标蛋白或核酸相关靶标 |
HRP 标记二抗孵育 | 将 HRP 定位到靶标附近 |
标记酪胺工作液孵育 | 产生局部荧光或生物素沉积 |
洗涤和终止 | 去除游离试剂，减少背景 |
复染、封片、成像 | 获得最终检测图像 |
4.2 关键操作要点
TSA 反应对浓度和时间较敏感。标记酪胺工作液通常应现配现用，反应时间应根据样本类型、靶标丰度和背景水平优化。
实验中应重点控制以下因素：
①一抗浓度不宜过高，否则会增加非特异性信号。
②HRP 二抗浓度需优化，过高可能导致背景增强。
③标记酪胺孵育时间过长可能导致信号扩散。
④H₂O₂ 浓度应按照试剂说明书配制。
⑤洗涤充分，避免游离酪胺或抗体残留。
5 TSA 常见问题与优化方法
5.1 信号弱
TSA 信号弱通常不是单一原因造成的，应从靶标、一抗、HRP 体系和酪胺反应四个方面排查。
可能原因 | 优化方法 |
靶标表达量过低 | 设置阳性对照，确认靶标可检出 |
一抗不适合 IHC、ICC 或 IF | 选择已验证应用场景的一抗 |
一抗浓度过低 | 适度提高一抗浓度或延长孵育时间 |
HRP 二抗活性不足 | 更换 HRP 二抗或检查保存条件 |
标记酪胺失效 | 使用新鲜配制工作液，避光操作 |
反应时间不足 | 在说明书范围内适度延长酪胺孵育时间 |
5.2 背景高
TSA 会放大特异性信号，也可能放大原本较弱的背景。背景控制是 TSA 实验成败的关键。
可能原因 | 优化方法 |
封闭不足 | 延长封闭时间或优化封闭液 |
一抗浓度过高 | 降低一抗浓度 |
HRP 二抗浓度过高 | 降低 HRP 二抗浓度 |
内源性过氧化物酶未充分淬灭 | 增加过氧化物酶淬灭步骤 |
酪胺反应过强 | 降低标记酪胺浓度或缩短孵育时间 |
洗涤不足 | 增加洗涤次数和洗涤时间 |
建议设置阴性对照，尤其是无一抗对照。若无一抗对照仍有明显信号，应优先检查内源性过氧化物酶、内源性生物素、组织自发荧光和二抗非特异性结合。
5.3 信号扩散或定位不清
TSA 的理想结果是信号集中在靶标附近。如果出现弥散荧光、细胞边界不清或亚细胞定位异常，通常说明放大反应过强。
可采用以下调整：
①缩短标记酪胺孵育时间。
②降低标记酪胺工作液浓度。
③降低 HRP 二抗浓度。
④减少一抗浓度。
⑤缩短曝光时间，避免成像阶段过曝。
定位不清时，不应优先通过提高曝光或增强图像对比度解决，而应回到染色条件本身进行优化。
5.4 多重染色串色或交叉反应
多重 TSA 实验常见问题包括荧光串色、上一轮抗体残留、强靶标干扰弱靶标等。优化重点包括：
问题 | 处理方法 |
荧光串色 | 选择光谱间隔更大的荧光组合 |
上一轮抗体残留 | 优化抗体去除或 HRP 灭活步骤 |
某一通道过亮 | 降低该靶标对应的抗体浓度或酪胺反应强度 |
弱靶标被强信号干扰 | 弱靶标优先安排高亮度、低背景通道 |
多标定位难判断 | 每个靶标先做单标图像确认 |
多重染色应包含单标对照、单色对照、无一抗对照和必要的光谱补偿或拆分设置。对于多轮 TSA 染色，建议增加上一轮残留对照，即完成某一轮染色和抗体去除或失活后，省略下一轮一抗，仅加入对应 HRP 二抗和 TSA 底物，确认上一轮抗体或 HRP 残留不会造成假阳性。没有单标验证和必要残留验证的多重结果，难以判断信号是否真实。
6 TSA 多重免疫荧光设计原则
6.1 先单标，后多标
TSA 多重免疫荧光不应直接从多抗体混合开始。合理流程如下：
①分别验证每个一抗的特异性和定位。
②确认每个靶标在样本中的表达强弱。
③确定每个荧光通道的曝光条件。
④再进行多重组合设计。
单标验证的目的不是获得最终数据，而是排除抗体不合适、背景过高和定位异常等基础问题。
6.2 按靶标强弱安排通道
多重实验中，弱靶标应优先使用更高灵敏度的 TSA 通道。强靶标应避免使用过强放大条件，否则容易遮盖弱信号或造成图像动态范围不足。
靶标类型 | 建议安排 |
弱表达靶标 | 高亮度荧光通道，优先优化 |
中等表达靶标 | 常规 TSA 条件或适度放大 |
强表达靶标 | 降低抗体浓度或缩短酪胺反应时间 |
定位精细靶标 | 避免过度放大，优先保证空间分辨率 |
6.3 控制每一轮染色残留
TSA 多轮染色中，前一轮抗体、HRP 活性或游离试剂残留都可能影响后续通道。每一轮完成后，应确保：
①HRP 活性已被有效终止。
②上一轮一抗和二抗已被充分去除或失活。
③洗涤充分，未残留游离酪胺。
④当前通道成像结果符合预期，再进入下一轮。
7 TSA 实验前检查清单
在正式开展 TSA 实验前，建议逐项确认以下内容：
检查项目 | 判断标准 |
靶标丰度 | 是否确实需要信号放大 |
一抗适用性 | 是否验证适用于 IHC、ICC、IF、ISH 或 FISH |
阳性对照 | 是否能证明靶标可被检测 |
阴性对照 | 是否能判断非特异性背景 |
HRP 二抗 | 是否与一抗宿主和实验体系匹配 |
内源性过氧化物酶 | 是否完成必要淬灭 |
酪胺工作液 | 是否现配现用并避光 |
孵育时间 | 是否经过预实验优化 |
荧光通道 | 是否与显微镜配置匹配 |
多重染色 | 是否完成单标和单色对照 |
自发荧光对照 | 是否掌握样本本底荧光水平 |
多轮残留对照 | 多轮 TSA 染色中，是否确认上一轮抗体或 HRP 残留不会影响后续通道 |
8 TSA 酪胺信号放大相关代表产品分类与应用推荐表
表1 TSA 核心底物与酶促放大反应产品
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
酪胺基础原料 | 51-67-2 | 酪胺 | Moligand™, ≥98% | 用于酪胺类底物合成、酪胺衍生物制备和酶促沉积反应研究 | |
酪胺盐形式原料 | 60-19-5 | 酪胺 盐酸盐 | ≥98% | 用于酪胺类标记底物制备、酶促反应条件研究和信号放大体系开发 | |
生物素酪胺底物 | 41994-02-9 | 生物素基酪酰胺 | ≥98%(HPLC) | 用于辣根过氧化物酶催化沉积、生物素-亲和素检测体系和低丰度靶标信号放大 | |
荧光酪胺底物 | —— | Cyanine 3 Tyramide methyl indole | ≥98% | 用于酪胺信号放大、多重免疫荧光、组织切片靶标定位和弱信号成像 | |
荧光酪胺底物 | —— | Cyanine 5 Tyramide methyl indole | ≥95% | 用于远红光通道酪胺沉积、多重免疫荧光组合和低丰度靶标检测 | |
即用型荧光酪胺底物 | —— | 即用型LumiDye™ 540酪胺 (200×) | BioReagent,用于显微镜,生物染色剂,适用于荧光分析,适用于免疫组织化学(for IHC),适用于免疫荧光(IF),for ELISA,即用型 | 用于免疫组织化学、免疫荧光、酶联检测和显微成像中的酪胺信号放大 | |
近红外荧光酪胺底物 | —— | 花青素CY7 酪酰胺 | ≥98% | 用于近红外通道酪胺沉积、多重免疫荧光和组织样本靶标检测 | |
酪胺放大缓冲液 | —— | 酪胺放大缓冲液 | BioReagent, 即用型, 适用于免疫荧光(IF) | 用于荧光酪胺沉积反应、免疫荧光检测和组织染色放大流程 | |
过氧化物酶淬灭/反应配套试剂 | 7722-84-1 | 过氧化氢 溶液 | 适用于微生物学, 3% | 主要用于内源性过氧化物酶淬灭；如用于 HRP 催化 TSA 反应体系，应按具体配方或试剂说明书稀释优化 |
表2 HRP 酶联、亲和素体系与抗体检测产品
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
生物素化酶 | 9003-99-0 | 生物素化辣根过氧化物酶 | 无载体,无叠氮钠,EnzymoPure™,1.0 mg/mL | 用于生物素-亲和素体系构建、辣根过氧化物酶催化反应和信号放大检测 | |
亲和素蛋白 | 9013-20-1 | 链霉亲和素 | BioReagent,≥98% | 用于结合生物素酪酰胺沉积位点和亲和捕获；若需成像、显色或发光信号输出，需配合荧光标记、酶标或其他检测体系 | |
亲和素蛋白 | 1405-69-2 | 亲合素 来源于鸡蛋白 | ≥98%, lyophilized powder,10-15 units/mg protein (E1%/280) | 用于生物素标记物识别和亲和捕获；用于组织染色体系时，需配合相应信号输出体系，并注意内源性生物素背景 | |
HRP标记亲和素 | —— | HRP 标记的链霉亲和素 | 高性能, 无叠氮钠, 1.0 mg/mL | 用于生物素酪酰胺沉积信号识别、酶促检测和组织染色放大 | |
HRP标记亲和素 | —— | HRP-Streptavidin | —— | 用于生物素化靶标检测、生物素酪酰胺体系和酶促信号输出 | |
HRP标记中性亲和素 | —— | HRP标记的中性亲和素 | ExactAb™, 已验证, 1.0 mg/mL | 用于生物素体系检测、酪胺放大后信号识别和组织样本靶标检测 | |
HRP标记二抗 | —— | Goat Anti-Chicken IgY H&L (HRP) | ExactAb™, 高性能, 已验证, 无叠氮钠, 1.0 mg/mL | 用于鸡源一抗检测、酪胺信号放大和组织免疫染色 | |
HRP标记二抗 | —— | Goat Anti-Human IgG H&L (HRP) | ExactAb™, 高性能, 已验证, 1 mg/mL | 用于人源 IgG 或人源一抗相关体系检测、酪胺沉积反应和免疫分析 | |
HRP标记二抗 | —— | Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | ExactAb™, 无叠氮钠, 已验证, 高性能, 预吸附, 1.0 mg/mL | 用于鼠源一抗检测、免疫荧光放大和免疫组织化学检测 | |
HRP标记二抗 | —— | Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | ExactAb™, 无叠氮钠, 已验证, 高性能, 预吸附, 1.0 mg/mL | 用于兔源一抗检测、低丰度靶标放大和多重染色流程 | |
HRP标记标签抗体 | —— | HA tag Mouse mAb (HRP) | ExactAb™, 已验证, 高性能, 0.5 mg/mL | 用于标签蛋白检测、重组蛋白定位和酪胺放大成像 | |
HRP抗体标记工具 | —— | HRP Antibody Labeling Kits（HRP抗体标记试剂盒） | —— | 用于制备辣根过氧化物酶标记抗体、建立酪胺放大检测流程和抗体检测体系 | |
HRP偶联物稳定剂 | —— | HRP 偶联物的稳定剂 | STplus | 用于辣根过氧化物酶偶联物保存、酶标抗体保存和酶标亲和素体系维护 | |
HRP偶联物稳定剂 | —— | HRP-StabilPLUS | Ready-to-use (RTU) | 用于辣根过氧化物酶偶联物保存、酶促检测体系维护和试剂稳定性控制 |
表3 缓冲液、抗原修复、封闭与通透配套产品
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
磷酸盐缓冲组分 | 7778-77-0 | 磷酸钾 一元 | 无水级, UltraBio™, 分子生物学级, ≥99.5%(T) | 用于磷酸盐缓冲液、洗涤液和组织染色反应体系配制 | |
柠檬酸抗原修复组分 | 5949-29-1 | 柠檬酸 一水合物 | 试剂级, ≥98%(GC/T) | 用于石蜡组织切片抗原修复液配制和染色前抗原暴露处理 | |
柠檬酸盐抗原修复组分 | 6132-04-3 | 柠檬酸钠三盐基 二水合物 | 欧洲药典（Ph.Eur）, 适用于分析, ACS, 优级品 | 用于柠檬酸盐抗原修复缓冲液、组织样本预处理和免疫染色前处理 | |
洗涤缓冲液表面活性剂 | 9005-64-5 | 吐温® 20 | 分子生物学级, viscous liquids | 用于洗涤缓冲液配制，减少抗体和游离底物非特异性残留 | |
缓冲液无机盐 | 7647-14-5 | 氯化钠 | 分子生物学级, ≥99.5%(AT) | 用于缓冲液渗透压调节、洗涤液配制和封闭体系配制 | |
缓冲液无机盐 | 7447-40-7 | 氯化钾 | 分子生物学级, ≥99.5% | 用于磷酸盐缓冲液配制、细胞样本处理和染色体系维护 | |
蛋白封闭剂 | 9048-46-8 | 牛血清白蛋白(BSA) | 低内毒素, 无蛋白酶, ≥98%, Lyophilized | 用于抗体稀释液配制、组织封闭和非特异性结合控制 | |
三羟甲基氨基甲烷缓冲组分 | 1185-53-1 | 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl) | 超纯级, ≥99%(T), useful in pH range 7.0-9.0 | 用于洗涤液、抗体稀释液和染色反应缓冲液配制 | |
封闭与抗体处理试剂 | 56-40-6 | 甘氨酸 | UltraBio™, 分子生物学级, 超纯级, ≥99%(NT) | 用于抗体处理、封闭体系、醛基相关背景控制和组织染色流程 | |
磷酸盐缓冲组分 | 7558-79-4 | 磷酸钠 二元 | UltraBio™, 分子生物学级, ≥99.5%(T) | 用于磷酸盐缓冲液、洗涤液、反应液和样本处理缓冲液配制 | |
细胞通透剂 | 9002-93-1 | Triton™ X-100 | UltraBio™, 超纯级 | 用于细胞膜通透、组织样本处理和细胞内靶标免疫染色 | |
即用型缓冲液 | 77-86-1 | Tris缓冲液 | 1.0 M，pH 8.0，分子生物学级 | 用于抗体稀释、洗涤和酪胺放大相关缓冲体系配制 | |
螯合型抗原修复组分 | 6381-92-6 | 乙二胺四乙酸二钠,二水 | GR, ≥99% | 用于螯合型抗原修复缓冲液、样本处理和染色条件优化 | |
荧光底物溶剂 | 67-68-5 | 二甲基亚砜 | ≥99.9%,Ultra dry,water≤50 ppm | 用于疏水性荧光底物、染料和相关小分子试剂储备液配制 |
表4 背景控制、核复染与荧光保存产品
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
细胞核复染试剂 | 23491-52-3 | Hoechst 33342 染色液 | 适用于免疫荧光(IF), BioReagent, 即用型, 生物染色剂, 适用于荧光分析, 生物染料级, 用于显微镜, 用于细胞培养, 1.0 mg/ml in H₂O | 用于免疫荧光成像、活细胞或固定细胞核染色、组织切片核定位 | |
自发荧光抑制试剂 | 4197-25-5 | 苏丹黑B | 生物染色剂 | 用于组织样本自发荧光降低、脂褐素背景处理和荧光成像背景控制 | |
抗荧光淬灭组分 | 106-50-3 | 对苯二胺 | 升华级, ≥99% | 用于荧光封片体系、多重荧光信号保存和显微成像样本制备 | |
醛基还原与背景控制试剂 | 16940-66-2 | 硼氢化钠(易制爆) | purum p.a.,≥96% | 用于固定样本醛基还原、自发荧光处理和组织背景降低 | |
抗荧光淬灭组分 | 280-57-9 | 1,4-二叠氮双环[2.2.2]辛烷(DABCO) | Moligand™, ≥98% | 用于荧光封片介质、信号保存和显微成像样本制备 | |
细胞核复染试剂 | 23491-45-4 | Hoechst 33258 染色液 | BioReagent, 生物染色剂, 生物染料级, 适用于免疫荧光(IF), 适用于荧光分析, 用于细胞培养, 用于显微镜, 即用型, 1.0 mg/mL in H₂O | 用于固定细胞、组织切片和免疫荧光样本核定位 | |
细胞核复染试剂 | 28718-90-3 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | ≥98% | 用于免疫荧光复染、组织切片核定位和多重成像结果判读 |
表5 HRP 显色、发光与检测延伸产品
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
HRP显色底物 | 54827-17-7 | 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB） | Standard for GC, ≥99%(GC) | 用于辣根过氧化物酶显色反应、酶联检测、微孔板读数和酶促检测体系评价 | |
HRP沉淀型显色底物 | 7411-49-6 | 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 | ≥99% | 用于免疫组织化学显色、辣根过氧化物酶检测和组织切片靶标定位 | |
HRP沉淀型显色底物 | 91-95-2 | 3,3'-二氨基联苯胺（DAB） | ≥99% | 用于免疫组织化学、组织切片靶标定位和辣根过氧化物酶显色检测 | |
HRP微孔发光底物 | —— | HRP 微孔发光底物 | —— | 用于辣根过氧化物酶微孔发光检测、微孔板信号读取和抗体检测体系评价 | |
HRP微孔发光底物稀释液 | —— | HRP 微孔发光底物稀释液 | —— | 用于辣根过氧化物酶微孔发光底物工作液配制和微孔板检测体系优化 | |
HRP膜发光底物 | —— | HRP 膜发光底物 | —— | 用于膜发光检测、酶标抗体信号观察和抗体性能验证 |
注：以上为阿拉丁代表产品，更多产品规格可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。
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