1. 为什么 ADC 不能只看抗体和 Payload？

        抗体药物偶联物（Antibody–Drug Conjugate，ADC）由三部分组成：单克隆抗体、连接子（Linker）和细胞毒性载荷（Payload）。抗体负责识别肿瘤相关抗原，Payload 负责杀伤细胞，Linker 则决定 Payload 是否能够在体内被安全携带，并在合适的位置释放。

首先要抓住一个核心矛盾：

Payload 必须足够强，才能杀伤肿瘤细胞；但它又不能在血液循环中过早释放，否则会造成系统毒性。

        因此，ADC 不能只看抗体是否靶向、Payload 是否强效。即使抗体亲和力高、Payload 毒性强，如果 Linker 在血浆中过早裂解，ADC 就会失去靶向递送优势，转变为游离毒性小分子的系统暴露；如果 Linker 过于稳定，Payload 进入靶细胞后释放不足，也会削弱疗效。ADC 的治疗效果取决于三者协同：

2. ADC Linker 是什么：从“连接结构”到“释放控制单元”

        ADC Linker 是抗体与 Payload 之间的共价连接单元。它一端连接抗体，另一端连接 Payload。表面上看，Linker 的作用是“连接”；但从药物设计角度看，它的真正作用是控制 Payload 的体内释放行为。

一个理想 Linker 需要同时满足三个要求。

2.1 血液循环中稳定

        ADC 给药后需要在血浆中循环，并到达肿瘤组织。如果 Linker 在循环中过早断裂，Payload 会提前释放，导致正常组织暴露增加，并降低到达肿瘤细胞的有效 ADC 浓度。

2.2 靶细胞内有效释放

        许多 ADC 依赖抗原介导的内吞进入细胞，随后进入内体和溶酶体。Linker 需要利用这些胞内环境特征释放 Payload，例如低 pH、蛋白酶、高还原性环境或溶酶体蛋白降解过程。

2.3 不显著破坏 ADC 的理化性质

        Linker-Payload 会改变 ADC 的疏水性、电荷分布、聚集倾向和药代动力学（Pharmacokinetics，PK）。如果 Linker-Payload 过度疏水，可能导致 ADC 更易聚集、非特异性摄取增加、血浆清除加快。

        为了更直观理解 ADC Linker 在 ADC 药物中的作用，可将其放入完整作用流程中观察。ADC Linker贯穿 ADC 从体内递送、靶细胞摄取到 Payload 释放和细胞杀伤的完整过程。下图以流程图形式概括了 Linker 在 ADC 稳定性、释放方式和治疗窗调控中的核心作用。

        上图展示了 ADC 从血液循环、靶点结合、内吞转运、胞内加工到 Payload 释放和细胞杀伤的主要过程。可裂解 Linker 可在酸性 pH、细胞内谷胱甘肽（Glutathione，GSH）或溶酶体蛋白酶作用下触发 Payload 释放；不可裂解 Linker 通常依赖抗体在溶酶体中降解，释放带连接子或氨基酸残基的活性代谢物。

        释放后的 Payload 可通过微管抑制、DNA 损伤或拓扑异构酶抑制等机制诱导肿瘤细胞死亡；当 Payload 具有一定膜通透性时，还可能扩散至邻近细胞并产生旁观者效应。Linker 的结构设计同时影响 ADC 的药效、毒性、药代动力学、疏水性和药物抗体比。

3. ADC 药物进入体内后的完整路径：结合、内吞、释放与杀伤

一个典型 ADC 从进入体内到杀伤肿瘤细胞，通常经历以下步骤。

3.1 血液循环：ADC 需要保持完整

        ADC 进入血液后，抗体、Linker 和 Payload 需要保持整体稳定。此阶段最重要的是避免 Payload 提前释放。血浆稳定性不足会增加游离 Payload 暴露，是 ADC 系统毒性的重要来源之一。

3.2 靶点结合：抗体识别肿瘤细胞表面抗原

        抗体与肿瘤细胞表面抗原结合。靶点选择不仅要看抗原在肿瘤组织中的表达水平，也要看其在正常组织中的表达情况，以及抗体结合后是否能够诱导内吞。

3.3 内吞与胞内运输：ADC 进入内体和溶酶体

        抗体-抗原复合物被细胞内吞后，进入早期内体、晚期内体，最终进入溶酶体。溶酶体具有酸性环境和多种蛋白酶，是许多 ADC 释放 Payload 的关键部位。

3.4 Linker 释放或抗体降解：Payload 形成活性分子

        对于可裂解 Linker，Payload 可通过酸敏感、还原敏感或酶敏感机制释放。对于不可裂解 Linker，通常需要抗体在溶酶体中被降解，释放带有 Linker 和氨基酸残基的 Payload 代谢物。

3.5 Payload 杀伤：作用于细胞内关键靶点

        释放后的 Payload 进入胞质或细胞核，作用于微管、DNA、拓扑异构酶 I 等关键靶点，诱导细胞周期阻滞、DNA 损伤或细胞死亡。

3.6 旁观者效应：影响抗原异质性肿瘤的杀伤范围

        如果释放出的 Payload 具有膜通透性，它可能从靶抗原阳性细胞扩散到邻近细胞，杀伤抗原低表达或阴性细胞。这种现象称为旁观者效应。旁观者效应有助于应对肿瘤抗原表达不均一，但也可能扩大正常组织毒性风险。

4. 可裂解 Linker：如何利用酸性、还原和酶切环境释放 Payload

        可裂解 Linker 的设计思路是利用靶细胞内，尤其是内体/溶酶体中的特征条件，或部分肿瘤相关微环境中的特征条件，使 Linker 在特定位置断裂，从而释放 Payload。常见可裂解 Linker 包括酸敏感 Linker、还原敏感 Linker 和酶敏感 Linker。

4.1 酸敏感 Linker：利用内体和溶酶体低 pH 触发释放

        酸敏感 Linker 常见代表是腙键 Linker。腙键在中性血浆环境中应尽量保持稳定，在酸性内体或溶酶体环境中发生水解，从而释放 Payload。

简化机理示意：

R¹R²C=N–NH–CO–Payload + H₂O + H⁺ 

→ R¹R²C=O + H₂N–NH–CO–Payload

酸敏感 Linker 的优势是触发条件明确；主要限制是血浆中稳定性需要严格控制。如果酸敏感键在循环中发生非特异性水解，可能导致 Payload 提前释放。

4.2 还原敏感 Linker：利用细胞内还原环境触发释放

        还原敏感 Linker 常见代表是二硫键 Linker。细胞内谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等还原性分子浓度通常高于细胞外环境，因此二硫键可以在胞内被还原断裂。

简化机理示意：

Antibody–Linker–S–S–Payload + 2 GSH

→ Antibody–Linker–SH + Payload–SH + GSSG

二硫键 Linker 的释放速度受二硫键邻近基团、空间位阻和细胞内还原环境影响。其设计重点是避免血液中过早还原，同时保证细胞内释放效率。

4.3 酶敏感 Linker：利用溶酶体蛋白酶切割

        酶敏感 Linker 是目前 ADC 设计中重要的一类。典型结构包括 Val-Cit、Val-Ala、GGFG 等肽段 Linker。这类 Linker 可被溶酶体蛋白酶识别并切割，随后通过自毁式间隔臂释放 Payload。

        其中，对氨基苄氧羰基（p-aminobenzyloxycarbonyl，PABC）是常见自毁式间隔臂。蛋白酶先切断肽段，PABC 随后发生 1,6-消除反应，释放接近游离形式的 Payload；具体释放形式取决于 Payload 的连接位点和官能团类型。

以下以胺类 Payload 通过氨基甲酸酯连接为例，简化机理示意：

Antibody–Val–Cit–PABC–Payload

-- 溶酶体蛋白酶切割 →

Antibody–Val–Cit + H₂N–PABC–Payload

-- PABC 自毁式消除 →

Payload–NH₂ + p-quinone methide + CO₂

        酶敏感 Linker 的优势是释放过程与 ADC 内吞-溶酶体运输路径高度匹配；主要风险是不同物种血浆酶活性不同，可能影响临床前模型与人体之间的转化判断。

5. 不可裂解 Linker：为什么更稳定，但旁观者效应通常较弱

        不可裂解 Linker 不依赖特定化学键在胞内直接断裂，而是依赖 ADC 被细胞内吞后，抗体部分在溶酶体中被蛋白酶降解，最终释放带有 Linker 和氨基酸残基的 Payload 代谢物。

        典型代表是 T-DM1，即曲妥珠单抗-美坦新偶联物（Trastuzumab Emtansine）。T-DM1 使用 SMCC 交联试剂形成不可裂解的 MCC 硫醚连接，将曲妥珠单抗与 DM1 偶联。ADC 进入 HER2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，人表皮生长因子受体 2）阳性细胞后，在溶酶体中降解抗体部分，生成 Lys-MCC-DM1 等活性代谢物。

不可裂解 Linker 释放示意：

Antibody–MCC–DM1

-- 溶酶体蛋白降解 →

Lys–MCC–DM1

不可裂解 Linker 的主要特点包括：

        不可裂解 Linker 的优势是稳定性较强，循环中过早释放 Payload 的风险通常相对较低；限制是对靶细胞内吞和溶酶体加工依赖更高。对于抗原表达均一、内吞效率高的靶点，不可裂解 Linker 可以提供较好的选择性；对于抗原异质性明显的实体瘤，其旁观者效应不足可能限制疗效。

6. Linker 如何影响药效、毒性、PK、DAR 和旁观者效应

        Linker 的作用不止是控制释放，它还会系统性影响 ADC 的疗效、安全性和体内分布。

6.1 药效：决定 Payload 是否能在靶细胞内形成有效浓度

        ADC 的细胞杀伤取决于释放到细胞内的活性 Payload 浓度。Linker 释放不足时，即使抗体成功结合并内吞，Payload 也可能无法达到有效浓度；释放过快或过早，则可能降低肿瘤部位有效递送量。

6.2 毒性：决定游离 Payload 的系统暴露

        Payload 通常具有极强细胞毒性。Linker 如果在血液中不稳定，会增加游离 Payload 或 Payload 相关代谢物的系统暴露。临床研究和系统评价提示，Linker 可裂解性、DAR 和系统性游离 Payload 暴露可能影响 ADC 系统毒性，但具体风险仍需结合 ADC 类型、靶点、Payload 和暴露水平综合判断。

6.3 PK：影响 ADC 清除、分布和暴露

        Linker-Payload 的疏水性会影响 ADC 的聚集倾向、非特异性摄取和血浆清除。研究显示，药物抗体比（Drug-to-Antibody Ratio，DAR）升高可增强体外细胞毒性，但也可能因整体疏水性增加而加快血浆清除，降低体内暴露；通过亲水性 Linker 或聚乙二醇化设计可改善这一问题。

6.4 DAR：影响效力、稳定性和安全性

        DAR 指每个抗体平均偶联的 Payload 数量。DAR 过低可能导致杀伤强度不足；DAR 过高可能增加疏水性、聚集、清除和毒性风险。Linker 的亲水性、偶联方式和偶联位点会影响 DAR 分布、偶联均一性，以及 ADC 在不同 DAR 条件下是否仍能保持可接受的理化性质。

6.5 旁观者效应：影响对抗原异质性肿瘤的杀伤能力

        可裂解 Linker 若释放膜通透性较好的 Payload，通常更容易产生旁观者效应；不可裂解 Linker 释放的带残基代谢物通常膜通透性较低，旁观者效应较弱。是否需要旁观者效应，应根据肿瘤抗原表达均一性和正常组织毒性风险综合判断。

7. 如何选择 ADC Linker：5 个判断维度

        ADC Linker 的选择没有固定答案，需要根据靶点、Payload、肿瘤特征和安全性要求综合判断。

7.1 靶点是否高效内吞

        如果靶点结合抗体后能够快速内吞，并进入溶酶体通路，酶敏感 Linker 或不可裂解 Linker 都可能适用。如果靶点内吞效率低，胞内释放不足会成为限制因素，需要重新评估该靶点是否适合 ADC 设计。

7.2 抗原表达是否均一

        如果肿瘤细胞普遍高表达靶抗原，可以优先考虑选择性更强、旁观者效应较低的设计。如果肿瘤抗原表达高度异质，具有旁观者效应的可裂解 Linker-Payload 组合可能更有优势。

7.3 Payload 是否需要以游离形式发挥活性

        某些 Payload 需要释放为接近游离药物的形式才能充分发挥活性，这时自毁式间隔臂非常重要。若释放产物带有较大残基，可能影响 Payload 与作用靶点结合。

7.4 Linker-Payload 是否过度疏水

        疏水性强的 Linker-Payload 容易增加 ADC 聚集和非特异性清除。对于高疏水 Payload 或高 DAR ADC，应考虑使用亲水性 Linker、PEG 间隔臂或位点特异性偶联策略改善整体性质。

7.5 安全窗是否足够

        如果靶点在正常组织中也有一定表达，或 Payload 毒性极强，应更重视血浆稳定性和释放选择性。如果治疗目标是抗原异质性明显的实体瘤，则需要在安全性可控的前提下评估旁观者效应的必要性。

8. 研究中如何验证 Linker 设计是否合理

Linker 设计是否合理，需要通过体外、细胞和体内实验逐层验证。

8.1 血浆稳定性

        检测 ADC 在人血浆和相关动物血浆中孵育后的完整性、DAR 变化和游离 Payload 释放情况。该实验用于判断 Linker 是否存在循环中过早裂解或脱偶联风险。

8.2 条件释放实验

根据 Linker 类型设计对应释放实验：

8.3 DAR 和偶联均一性分析

        通过液相色谱-质谱、疏水相互作用色谱、还原和非还原质谱等方法分析 DAR 和偶联分布。DAR 分布越宽，ADC 批次一致性和体内行为越难控制。

8.4 聚集和理化稳定性

        通过 SEC-HPLC、动态光散射、差示扫描荧光法或差示扫描量热法评价 ADC 聚集、纯度和热稳定性。Linker-Payload 即使释放机制合理，如果导致明显聚集，也不适合进一步开发。

8.5 抗原阳性与阴性细胞毒性比较

        ADC 应对抗原阳性细胞表现出更强杀伤，对抗原阴性细胞杀伤较弱。该实验用于确认 ADC 的杀伤是否依赖抗体靶向递送，而不是游离 Payload 或非特异性摄取。

8.6 旁观者效应实验

        将抗原阳性细胞和抗原阴性细胞共培养，观察 ADC 是否能杀伤邻近抗原阴性细胞。该实验适用于评估可裂解 Linker 与膜通透性 Payload 组合的扩散杀伤能力。

8.7 体内 PK、疗效和安全性

        体内评价应同时检测总抗体、偶联抗体、游离 Payload、肿瘤抑制率和毒性指标。把稳定性、释放效率、肿瘤暴露和正常组织毒性放在同一体系中分析，才能判断 Linker 是否真正改善 ADC 的治疗窗。

9. ADC连接子与载荷相关代表化学品分类表

表1. 酶敏感可裂解连接子与自毁式释放单元

表2. 酸敏感、还原敏感与可水解释放连接子

表3. 稳定硫醚交联剂、马来酰亚胺/点击偶联工具与功能化连接子

表4. 微管抑制剂与DNA损伤类游离载荷

表5. MMAE、MMAF与微管抑制类连接子-载荷偶联物

表6. 拓扑异构酶抑制剂、美登素类与其他连接子-载荷偶联物

注：以上为阿拉丁代表性科研用 ADC 连接子、载荷及连接子-载荷构建模块，具体产品名称、CAS号、货号、纯度、规格、储存条件、COA 与 SDS 信息以阿拉丁官网产品页为准。相关产品仅供科研使用，不用于临床诊断、治疗或人体应用。涉及高活性细胞毒载荷或连接子-载荷偶联物时，应按照 SDS 要求在合规防护条件下操作。

参考文献

[1] Su Z, Xiao D, Xie F, Liu L, Wang Y, Fan S, Zhou X, Li S. Antibody–drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2021;11(12):3889–3907. doi:10.1016/j.apsb.2021.03.042.

[2] Bargh JD, Isidro-Llobet A, Parker JS, Spring DR. Cleavable linkers in antibody–drug conjugates. Chemical Society Reviews. 2019;48(16):4361–4374. doi:10.1039/C8CS00676H.

[3] Balamkundu S, Liu C-F. Lysosomal-cleavable peptide linkers in antibody–drug conjugates. Biomedicines. 2023;11(11):3080. doi:10.3390/biomedicines11113080.

[4] Lyon RP, Bovee TD, Doronina SO, Burke PJ, Hunter JH, Neff-LaFord HD, Jonas M, Anderson ME, Setter JR, Senter PD. Reducing hydrophobicity of homogeneous antibody-drug conjugates improves pharmacokinetics and therapeutic index. Nature Biotechnology. 2015;33(7):733–735. doi:10.1038/nbt.3212.

[5] Tang SC, Wynn C, Le T, McCandless M, Zhang Y, Patel R, Maihle N, Hillegass W. Influence of antibody–drug conjugate cleavability, drug-to-antibody ratio, and free payload concentration on systemic toxicities: A systematic review and meta-analysis. Cancer and Metastasis Reviews. 2025;44:18. doi:10.1007/s10555-024-10231-5.

[6] Erickson HK, Lewis Phillips GD, Leipold DD, Provenzano CA, Mai E, Johnson HA, Gunter B, Audette CA, Gupta M, Pinkas J, Tibbitts J. The effect of different linkers on target cell catabolism and pharmacokinetics/pharmacodynamics of trastuzumab maytansinoid conjugates. Molecular Cancer Therapeutics. 2012;11(5):1133–1142. doi:10.1158/1535-7163.MCT-11-0727.

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