三色染色是一类通过核染、胞质/肌纤维染色、胶原或基质终染及分化步骤，在同一组织切片中显示多类结构成分的组织化学方法。其核心价值不在于简单形成三种颜色，而在于通过不同组织成分对染料、媒染剂和分化条件的差异反应，建立可用于形态判读、纤维化评价、骨基质观察和组织结构分层的染色体系。

        关键词：三色染色；Masson染色；Goldner染色；Mallory染色；Azan染色；Gomori染色；Pollak染色；Van Gieson染色；胶原纤维；骨基质；纤维化；组织化学染色

1、三色染色体系的基本逻辑

1.1 结构显示目标

（1）细胞核

        三色染色通常先显示细胞核，为组织结构定位提供基础。常用核染包括Weigert铁苏木精、Heidenhain铁苏木精及部分改良苏木精体系。由于后续步骤常涉及酸性染液、磷钼酸/磷钨酸分化和胶原终染，耐酸性较好的铁苏木精更适合多步三色染色流程，可减少核染在后续酸处理中的褪色。

（2）胞质与肌纤维

        胞质、肌纤维、红细胞和部分细胞内蛋白结构常通过酸性品红、丽春红、Biebrich Scarlet、橙黄G等染料显示，多呈红色、粉红色或橙红色。该步骤决定细胞性成分与胶原性基质之间的基础对比，是三色染色能否清晰区分肌纤维和胶原的关键。

（3）胶原与细胞外基质

        胶原纤维、结缔组织基质、骨基质和纤维化区域常由苯胺蓝、亮绿SF或固绿等酸性染料终染。不同终染染料会决定胶原或基质最终呈蓝色、绿色或蓝绿色，并影响后续图像分析、纤维化定量和组织结构判读。

1.2 染色机制要点

（1）染料竞争

        三色染色依赖不同酸性染料对组织蛋白的竞争性结合。前段红色染料先与细胞质、肌纤维和部分胶原区域结合，随后通过磷钼酸或磷钨酸等分化/媒染步骤，使胶原区域更易接受后段终染染料。该过程决定胶原与细胞性成分之间的颜色分离效果。

（2）分化控制

        分化不足会导致红色染料残留，胶原显示不清；分化过度则可能使细胞性结构褪色，降低组织层次。三色染色的稳定性很大程度取决于分化时间、酸性环境、洗涤强度、固定条件和切片厚度。

（3）终染选择

        终染染料决定胶原和基质的最终颜色。苯胺蓝常用于胶原蓝染，亮绿SF常用于绿色胶原或骨基质显示，固绿则多见于固绿法Masson、改良三色染色及骨软骨相关复染体系。不同终染体系之间不宜直接混用判读标准。

表1 三色染色的结构分工与常用染料

2、主要三色染色体系

2.1 Masson三色染色

（1）方法定位

        Masson三色染色是胶原纤维和纤维化观察中应用最广的三色染色体系之一，主要用于区分细胞核、胞质/肌纤维和胶原纤维。其适用范围包括肝纤维化、肾间质纤维化、肺纤维化、心肌纤维化、皮肤瘢痕、肿瘤间质纤维化和组织损伤修复评价。

（2）基本原理

        Masson三色染色利用酸性染料对不同组织蛋白结合能力的差异进行分层。细胞核先经铁苏木精染色，胞质和肌纤维经酸性品红、丽春红或Biebrich Scarlet类染料显示为红色，再经磷钼酸或磷钨酸分化，使胶原区域接受苯胺蓝、亮绿SF或固绿等终染染料。分化步骤是Masson染色的核心，决定红色细胞性成分与蓝色或绿色胶原之间的边界清晰度。

（3）典型结果

        常见结果为细胞核黑蓝色，胞质、肌纤维和红细胞红色，胶原纤维呈蓝色或绿色。苯胺蓝型Masson显示蓝色胶原，适合纤维化面积分析；亮绿SF型或固绿法Masson显示绿色胶原或基质，适合绿色胶原输出、显微图像展示和方法比较。

（4）应用重点

        Masson三色染色的重点是胶原沉积范围、纤维化分布、肌纤维与间质边界以及组织修复区域的结构变化。用于肝纤维化时，应关注门管区、汇管区桥接纤维化和假小叶形成；用于心肌组织时，应关注血管周围胶原、心肌间质胶原和瘢痕区；用于肿瘤间质时，应结合肿瘤细胞巢、间质比例和胶原束排列综合判断。

（5）局限性

        Masson染色显示的是组织化学意义上的胶原/基质区域，并不区分胶原亚型。若需区分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原或胶原成熟程度，应结合免疫组化、偏振光天狼星红或分子检测。用于图像定量时，应统一切片厚度、染色批次、扫描参数和颜色阈值。

2.2 Goldner三色染色

（1）方法定位

        Goldner三色染色常用于骨组织、矿化组织和骨形成相关样本，适合观察骨基质、类骨质、细胞性成分和结缔组织基质之间的空间关系。该方法在骨代谢、骨修复、骨植入材料评价、骨形成模型和矿化基质研究中具有较高应用价值。

（2）基本原理

        Goldner体系通过核染、酸性红染和绿色终染建立骨组织结构分层。细胞核通常呈深色，细胞性成分和部分未矿化区域呈红色或橙红色，成熟骨基质、矿化基质或胶原性区域多呈绿色。亮绿SF是该体系中较具代表性的绿色终染染料，可突出骨基质和成熟胶原性区域。

（3）典型结果

        骨组织中，矿化骨基质常呈绿色，类骨质或细胞性区域可呈红色至橙红色，细胞核呈深色。该体系有利于观察骨小梁结构、骨基质沉积、骨形成边界、骨修复过程和材料周围新生骨组织分布。

（4）应用重点

        Goldner染色的重点不是单纯测量胶原面积，而是区分矿化骨基质、未矿化类骨质、细胞性成分和骨组织背景。对于骨形成模型、骨缺损修复、骨植入材料周围组织反应等样本，Goldner体系比普通Masson更能反映骨组织分层和矿化状态。

（5）局限性

        脱钙方式、脱钙时间和包埋方式会显著影响骨基质显色。脱钙过度可能导致基质保存和颜色稳定性下降，未脱钙样本则对切片质量和染色渗透要求更高。用于骨组织比较研究时，应在同一实验中保持脱钙、切片和染色条件一致。

2.3 Mallory三色染色

（1）方法定位

        Mallory三色染色是经典组织化学三色染色体系之一，用于显示胶原纤维、结缔组织、肌纤维、红细胞和部分细胞成分的多色分层。该方法适合结缔组织结构展示、多成分组织对比和三色染色方法学比较。

（2）基本原理

        Mallory体系通常通过酸性品红、橙黄G和苯胺蓝等染料组合建立颜色分层。不同组织成分因蛋白性质、组织密度和染料亲和力不同而呈现蓝色、红色或橙色。苯胺蓝主要用于胶原和结缔组织蓝染，橙黄G常用于红细胞或角化结构对比，酸性品红类染料显示胞质和肌纤维。

（3）典型结果

        胶原和结缔组织多呈蓝色，胞质或肌纤维可呈红色至红橙色，红细胞或角化结构可呈橙色。该方法颜色层次较丰富，适合观察组织构筑、胶原束分布、细胞性成分与间质之间的相互关系。

（4）与PTAH体系的关系

        Mallory磷钨酸苏木素染色（PTAH）与Mallory相关，但其应用重点更偏向肌纤维、横纹、纤维蛋白和部分组织结构对比，并不等同于以胶原终染为核心的典型三色体系。正文中可作为Mallory相关组织化学方法补充，不宜与Masson或Goldner的胶原终染体系混同。

（5）局限性

        Mallory体系操作步骤较多，分化条件对颜色层次影响明显。若用于胶原面积定量，需先确认蓝色结构与目标胶原区域的一致性。若目标是标准化纤维化面积分析，Masson体系通常更便于建立稳定阈值。

2.4 Azan三色染色

（1）方法定位

        Azan三色染色是一类以偶氮胭脂红、橙黄G和苯胺蓝等染料构建多色对比的三色体系，常用于胶原、结缔组织、肌组织和细胞成分的结构分层观察。其名称中的“Azan”通常指偶氮胭脂红与苯胺蓝相关组合，强调多成分组织结构的差异显示。

（2）基本原理

        Azan体系通过偶氮胭脂红类染料显示细胞核和部分细胞质结构，橙黄G提供红细胞或部分胞质结构的橙色对比，苯胺蓝显示胶原和结缔组织。其关键在于多染料竞争和分化步骤的协调，使不同组织成分呈现稳定分层。

（3）典型结果

        细胞核和部分胞质结构可呈红色至红紫色，红细胞或特定胞质成分可呈橙色，胶原和结缔组织多呈蓝色。相比Masson，Azan更强调整体组织结构层次，而不只是纤维化面积评价。

（4）应用重点

        Azan适合观察胶原束分布、结缔组织结构、细胞间质关系和组织构筑变化。对于胚胎组织、结缔组织丰富样本、腺体间质和需要多成分分层显示的样本，Azan可提供较丰富的结构信息。

（5）局限性

        Azan染色对分化条件较敏感，不同实验室间结果差异可能较大。若将胶原蓝染体系改为绿色终染，应视为方法改良，不宜与经典Azan结果直接等同。

2.5 Gomori三色染色

（1）方法定位

        Gomori三色染色常用于肌肉病理、结缔组织观察和组织结构分层，尤其适合骨骼肌病理中肌纤维、结缔组织和异常线粒体相关结构的观察。其代表性应用包括改良Gomori三色染色在肌肉活检中的异常结构显示。

（2）基本原理

        Gomori三色染色通过核染、酸性染料复合染色和分化步骤显示肌纤维、结缔组织及异常结构。不同改良版本的配方差异较大，颜色输出也不完全一致，因此判读时必须结合具体方法体系。

（3）典型结果

        肌纤维、胶原/间质和部分异常结构可呈现不同颜色层次。改良Gomori三色染色常用于骨骼肌活检中观察肌纤维结构异常、破碎红纤维样改变、间质增生和病理性沉积。

（4）应用重点

        Gomori三色更偏向肌肉病理和特定异常结构显示，不是单纯胶原面积评价的首选方法。若研究目标为肝、肺、肾或心肌纤维化定量，Masson苯胺蓝法或亮绿法通常更直接。

（5）局限性

        Gomori体系改良版本较多，不同试剂盒或实验室配方的颜色表达可能不同。用于跨批次比较时，应设置同批阳性对照并统一判读标准。

2.6 Pollak三色染色

（1）方法定位

        Pollak三色染色属于组织多结构分层显示方法，可用于结缔组织、细胞性成分和基质结构的对比观察。与Masson和Goldner相比，Pollak体系在常规纤维化定量和骨基质判读中的使用频率较低，但可作为三色染色方法学扩展。

（2）基本原理

        Pollak三色染色通常依赖多种酸性染料和分化步骤建立组织结构反差。其重点不是单独显示胶原，而是通过多色对比呈现细胞性成分、间质和组织背景之间的层次。

（3）典型结果

        具体颜色表现与配方相关。部分体系可显示细胞性成分、胶原性基质和背景组织之间的多色分层，用于组织结构观察和方法学对照。

（4）应用重点

        Pollak三色染色更适合作为多结构组织成分分层方法，用于与Masson、Mallory、Azan等体系进行比较。若研究重点是纤维化定量，仍需优先考虑标准化程度更高的Masson体系。

（5）局限性

        Pollak体系是否直接使用绿色或蓝色基质终染，需要结合具体配方判断。若配方不同，应作为方法型三色染色产品处理，而不是直接纳入某一种终染染料体系。

2.7 Van Gieson相关染色

（1）方法定位

        Van Gieson染色常用于胶原和肌性组织区分，典型结果为胶原红色、肌纤维和胞质黄色。严格而言，它不属于以“核染—胞质/肌纤维—胶原终染”完整构建的典型三色体系，但常与Masson、Goldner等方法共同用于结缔组织染色比较。

（2）基本原理

        Van Gieson体系通过酸性品红和苦味酸等组分使胶原与肌性组织呈现不同颜色。胶原通常呈红色，肌纤维和胞质呈黄色，细胞核由相应核染显示。

（3）应用重点

        Van Gieson适合快速显示胶原纤维和肌性组织差异，可作为三色染色之外的胶原观察对照方法。在组织结构快速比较、胶原分布初步观察和方法学参照中具有应用价值。

（4）局限性

        Van Gieson胶原红染结果与Masson蓝/绿胶原显示不同，不宜与Masson或Goldner结果直接合并定量。用于图像分析时，应单独建立颜色阈值和判读标准。

表2 常用三色及相关染色体系比较

3、终染颜色与结构判读

3.1 蓝色胶原体系

（1）方法特点

        蓝色胶原体系以苯胺蓝为代表，常见于Masson、Mallory和Azan相关染色中。胶原纤维、纤维化区域和结缔组织基质多呈蓝色至蓝紫色，与红色胞质、肌纤维和红细胞形成明确对比。

（2）应用场景

        蓝色胶原体系适合肝、肾、肺、心肌、皮肤和肿瘤间质纤维化评价，也适用于胶原束、瘢痕组织和结缔组织增生观察。对于图像分析，蓝色胶原通常更利于建立相对稳定的颜色阈值。

（3）技术风险

        苯胺蓝染色不足会导致胶原蓝色偏淡；染色过度或洗涤不足会造成背景偏蓝。用于定量分析时，应保持切片厚度、染色批次、扫描参数和阈值设置一致。

3.2 绿色胶原或基质体系

（1）方法特点

        绿色终染体系常涉及亮绿SF或固绿。亮绿SF更常用于Goldner三色、绿色Masson变法和骨基质显示；固绿则多见于固绿法Masson、改良三色染色和骨软骨相关复染体系。

（2）应用场景

        绿色胶原或基质体系适合骨组织、矿化基质、骨修复区域和需要绿色胶原输出的组织展示。Goldner体系中的绿色信号更偏向骨基质和成熟胶原性区域，固绿相关体系则需结合具体方法判断其结构意义。

（3）技术风险

        绿色染料过染时容易导致背景偏绿，造成间质边界模糊或阳性面积高估。固绿在不同体系中的绿色信号不一定等同于胶原阳性，尤其在软骨、骨组织和复染体系中需结合方法背景解释。

3.3 红色胶原对照体系

（1）方法特点

        Van Gieson相关染色中，胶原通常呈红色，肌纤维和胞质呈黄色。其结果与Masson或Goldner中的蓝色/绿色胶原体系不同，更适合作为胶原观察的对照方法。

（2）应用场景

        该体系适合快速比较胶原与肌性组织，也适合与Masson、Goldner等三色体系共同用于方法学对照。但不同显色体系之间不应直接合并计算胶原面积。

表3 不同终染颜色的判读差异

4、三色染色结果判读

4.1 胶原与纤维化

（1）胶原沉积范围

        Masson三色染色常用于评估胶原沉积范围。胶原可呈蓝色或绿色，具体取决于终染体系。判读时应重点观察胶原位于间质、血管周围、被膜、瘢痕区还是组织实质内。

（2）纤维化程度

        纤维化评价不应仅依赖颜色深浅，而应结合阳性面积、结构分布、组织破坏程度和病变区域定位。图像分析应统一阈值、切片厚度和染色批次。

（3）背景干扰

        过度终染、分化不足或洗涤不充分均可导致背景染色增强，使胶原区域被高估。判读前应先确认红色胞质/肌纤维、核染和胶原终染是否处于平衡状态。

4.2 肌纤维与胶原边界

（1）Masson体系

        Masson染色能够清楚区分红色肌纤维和蓝色/绿色胶原，适合心肌、骨骼肌和平滑肌组织中的间质纤维化观察。若红染不足，肌纤维边界会变弱；若胶原终染过度，则可能掩盖细胞性结构。

（2）Gomori体系

        Gomori三色更偏向肌肉病理和肌纤维结构异常观察，适合肌纤维结构、间质和特定异常结构的整体判读。该体系不宜直接替代Masson作为纤维化面积定量方法。

（3）Mallory与Azan体系

        Mallory和Azan强调多结构分层，适合观察胶原、红细胞、细胞质和结缔组织之间的层次关系。用于纤维化面积定量时，应确认颜色阈值和阳性结构定义。

4.3 骨基质与骨软骨界面

（1）Goldner体系

        Goldner三色适合显示骨基质和矿化组织结构，亮绿SF常用于成熟骨基质或胶原性基质终染。对于骨形成模型和骨组织修复评价，应优先考虑该体系。

（2）固绿相关复染

        番红O-固绿、骨组织番红固绿和软骨相关染色中，固绿常用于背景基质或骨组织对比。此类体系与典型三色染色相关，但判读对象不同，需与Masson或Goldner区分。

表4 三色染色结果判读要点

5、三色染色相关试剂体系

5.1 成品方法体系与组织适配

表5 三色染色成品方法体系与组织适配

5.2 胶原与基质终染染色液

表6 胶原与基质终染染色液配置

5.3 核染与细胞性成分显色配套试剂

表7 核染与细胞性成分显色配套试剂

5.4 固绿相关骨软骨基质对比染色产品

表8 固绿相关骨软骨基质对比染色产品

        常用三色染色体系的选择应围绕样本类型、目标结构和结果用途展开。Masson三色适合胶原和纤维化评价，Goldner三色适合骨基质和矿化组织观察，Mallory和Azan更强调多结构组织分层，Gomori偏向肌肉病理和特殊结构显示，Van Gieson可作为胶原对照染色。

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[1] Masson三色染色（Masson’s Trichrome Stain）标准操作规程